Реакция преципитации в агаре ( геле )

 Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар-агара. 

Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата. Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями. 

 В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях. Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони.

 Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

 

Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена. В зависимости от специфичности заключенных в геле антител в ходе иммунодиффузии возникает одна или несколько полос преципитации, длина «пробега» которых от «линии старта» пропорциональна концентрации антигена. К усовершенствованным вариантам относятся: двойная радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони) и простая радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. Основная функция геля — локализация преципитата, основана на том, что растворимые антигены и антитела легко диффундируют в геле, а образующиеся иммунные комплек­сы ввиду их большей величины задерживаются внутри ячеек геля, образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное рас­положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

 

Имуноелектрофорез является сочетанием двух методов – электрофореза в геле и следующей после него двойной иммунодифузии.

Для проведения реакции иммуноелектрофорезу используют стеклянные пластинки, предметные стёклышки, на которые наносят тонкий слой агара или агарози. Сначала антигены размещают в центре пластинки и разделяют их в электрическом поле. Потом в канавку, сделанную в агаре параллельно к линии раздела антигенов, вносят специфическую сыворотку. Диффундируя друг навстречу другу, антигены и антитела в месте контакта образуют дуги преципитации.

Практическое применение реакции преципитации. 

РП применяются: 

- для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и  животных; 

- для изучения токсигенности бактерий;

- при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной, грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.); 

 В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жидкость и т.д. 

- для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных –  определяют общий АГ; 

- в судебно-медицинской практике – для определения видовой принадлежности  белков (крови, слюны, спермы и т.д.); 

- для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях. 

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат . f1оecus - хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл. 

Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт стандартных препаратов.