Радиоиммунологический анализ (риа)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологичес­ким реакциям, с простотой и высокой чувствительностью оп­ределения. По сравнению с обычными иммунологическими ме­тодами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие поли­меры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают спо­собностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген — антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необ­ратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологичес­кого материла.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлю­лоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ифа)

Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой катали­тической активностью, позволяющей с помощью соответствую­щих субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 1СР¹⁵ моль/л и ниже. Принципиально решена

проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител.

Наиболее широкое применение находит твердофазный имму-ноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинил-хлорида. Один из наиболее распространенных на практике ва­риантов ИФА основан на использовании меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе ин­кубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген — антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные фер­ментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определя­ют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антивидовых антител выявляют специфические иммунокомплек-сы. Данная схема является одной из наиболее распространен­ных в ИФА.

С целью максимального упрощения использования ИФА разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анали­за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед­ствие образования продукта ферментативной реакции.

Области применения и чувствительность ИФА аналогичны РИА. Однако ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабиль­ность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко под­дается автоматизации.

Чаще всего для ИФА используют полистироловые, поливиниловые пластинки с лунками, которые позволяют адсорбционно связывать АТ и АГ различной природы – белки, ЛПС, гликопротеиды и т.д. Связывание происходит путем адсорбции (т.е. нековалентно) за счет гидрофобных или ионных сил, или конъюгацией (ковалентно). Для получения иммуносорбентов путем ковалентной связи ис пользуют в основном такие сшивающие реагенты, как

бромциан, глутаральдегид, изоцианаты, при этом в качестве твердой фазы применяют целлюлозу, биогель, сефадекс, агарозу и др. 

Методы ТИФА применимы и при работе с корпускулярным АГ, например, клетками бактерий и эукариот. Клетки бактерий можно прикрепить к панели высушиванием и усилить прикрепление фиксатором. 

 Например, перед адсорбцией клеток бактерий панели обрабатывают поли-L- лизином  в течение 1 часа, лунки промывают и вносят бактериальную взвесь (100мкл взвеси  5х103 - 5х104 в мл ), инкубируют 45 минут и фиксируют 

глутаровым альдегидом в  течение 3-5 минут. После связывания иммунореагента свободные места носителя  блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связывание с ним  иммунореагентов на следующих этапах. Для этого применяют различные белки и  реагенты: БСА (бычий сухой альбумин), нормальные сыворотки, твин-20, желатин. 

3.2. Варианты ТИФА. 

 Существуют неконкурентные и конкурентные варианты. 

При неконкурентных вариантах реакция АГ-АТ происходит на поверхности твердой  фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству  искомого АТ или АГ в исследуемом образце. 

 При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ  или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству  искомого образца. 

 Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометров, измеряя оптическую плотность в опытных и контрольных лунках.

При визуальном учете реакцию расценивают как положительную, если в лунках наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, значительно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательными контролями. 

 ИФА обладает следующими преимуществами: 

 высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата; 

- возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала; 

- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); 

- простотой проведения реакции; 

- наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета. 

Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины. 

Иммуноблотинг ( ИБ) 

 В основе этого метода лежит использование нитроцеллюлозных полосок, на которые методами горизонтального и затем вертикального электрофореза переносятся АГ в порядке нарастания их молекулярных масс. 

 При проведении исследования эти полоски, помещенные в индивидуальные пластиковые кюветы, последовательно взаимодействуют с сывороткой (иммунной или испытуемой), конъюгатом и субстратом в условиях горизонтального встряхивания с целью перемешивания и равномерного взаимодействия реагентов с полоской по всей ее длине. 

 После завершения контакта с очередным ингредиентом полоску промывают специальным раствором для удаления несвязавшихся компонентов.

При наличии специфичности искомых АГ (АТ) известным АТ (АГ) они связываются в иммунные комплексы в определенных зонах полоски. К этому комплексу присоединяются конъюгат, представляющий собой антивидовые антитела, меченые пероксидазой или другим ферментом. После контакта с субстратом, в местах связывания образуется окрашенный продукт, по локализации и интенсивности окрашивания которого делают визуальное заключение о реакции. 

Радиоиммунологический анализ (РИА) – это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов. 

 Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА). В качестве радиоактивной метки используюи три типа изотопов – 3Н, 14С, 125 I (или 131 I ). Наиболее популярный способ получения коъюгатов – метка радиоактивным иодом, т.к. этот метод введения метки практически не снижает иммунологической активности антигенов и антител в процессе формирования ИК. 

Чаще всего в РИА используется Y-изотоп – 125I, имеющий более длительное (60 дней) время полураспада, чем радионуклеоид 131 I (8 дней). 

 Методика РИП заключается в 1) формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген-антитело радиоактивной метки), 2) отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул, 3) анализе его 

радиоактивного компонента. 

Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико-химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором ком плекс антиген-антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. . Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте-