Основы метода пцр.

 

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: 

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); 

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК); 

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей). 

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний. 

1. Прямое определение наличия возбудителей. 

 Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. 

2. Высокая специфичность

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3. Высокая чувствительность. 

 Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. 

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. 

 Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. 

5. Высокая скорость получения результата анализа. 

 Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа. 

 

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. 

 Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. 

Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

 

Применение пцр в практическом здравоохранении.

 Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение 

этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов. Используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. 

Амплификатор ICycler IQ-5 (Bio-Rad, США) – прибор с системой детекции флуоресцентного сигнала в  режиме «реального времени»

 

Показания к применению метода ПЦР при различных заболеваниях.

 1.Применение ПЦР в урогинекологической практике. 

 2. Применение в неопатологии. 

 3. Применение ПЦР в практике службы крови. 

 4. Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии. 

 5. Применение ПЦР в клинике инфекционных заболеваний. 

 6. Применение ПЦР в иммунологии. 

 7.Применение ПЦР в онкологии и др. 

 

Иммунопатологические реакции и иммунодефицитные состояния

 

Четыре типа реакций гиперчувствительности за Coombs и Gell:

Гиперчувствительность немедленного типа

1. Реакции анафилактические, атопические.

2. Реакции цитолитические, цитотоксические.

3. Реакции    иммунных комплексов (гистотоксичные).

Гиперчувствительность замедленного типа

4. Реакции туберкулинового типа.                       

 Аллергены разделяются на неинфекционные и инфекционные. Наиболее многочисленной и разнообразной является группа неинфекционных аллергенов.

      К ним относятся: пыльцевые, бытовые, эпидермальные, пищевые аллергены.