Реакция лизиса и связывание комплемента.

 

Для реакции лизиса необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий - бактериолизины, спирохет - спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других клеток - цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) - антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза. 

 

Реакция связывания комплемента (РСК). Характерным отличием РСК от реакции агглютинации и преципитации есть участие в ней, кроме антигена и антитела, ингредиентов реакции гемолиза, которая выступает в виде индикаторной системы. Взаимодействие антигена с антителом не всегда предопределяет визуальные изменения, которые позволяют определить результат реакции. Однако известно, что при образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

Постановка и учет РСК

 

Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы реагентов РСК. 

Антитела (Ig M, Ig G), участвующие в РСК, характеризуются способностью связывать комплемент. Исследуемую сыворотку накануне постановки реакции прогревают на водяной бане при температуре 56

 С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. В день постановки реакции сыворотку разводят раствором хлорида натрия (0, 15 моль/л) в соотношении 1 : 5 (для качественного анализа) или же готовят ряд последовательных, кратных двум разведений – от 1 : 5 до 1 : 640 (для определения титра АТ).

Антигены, используемые в РСК, могут быть корпускулярными или растворимыми: взвеси бактериальных клеток, их лизаты. Белковые или полисахаридные вещества, экстракты из нормальных и патологически изменённых тканей. 

Комплементом является смесь сывороток морских свинок – свежая или лиофилизированная (сухой комплемент – препарат промышленного изготовления), которую разводят раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 непосредственно перед употреблением, так как при хранении в жидком состоянии её активность снижается. 

Гемолитическую сыворотку с известным титром АТ (1 : 1200, 1 : 1600, 1 : 1800) изготовляют промышленным путём, иммунизируя кроликов эритроцитами барана.

Эритроциты получают из дефибринированной крови барана. Кровь фильтруют через трёхслойный марлевый фильтр для удаления плёнок фибрина, затем фильтрат центрифугируют (2000 мин

-1) в течение 10 мин. Удаляют плазму, а эритроциты наоборот остаются.

Поэтому антигены перед проведением опыта титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. 

а) антиген разводят в объёмах 0,5 мл; 

б) добавляют в каждую пробирку 0, 5 мл рабочей дозы комплемента; 

в) помещают в термостат при температуре 37  С на 1 час;

г) добавляют во все пробирки по 1, 0 мл гемолитической системы; 

д) помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час; 

 

Опытная системаАНТИГЕН (Бактерия,  клетка, вирус и т.д.) КОМПЛЕМЕНТ АНТИТЕЛО (сыворотка)  Комплемент связался  с комплексом антиген-антитело

Индикаторная  гемолитическая система ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА (АНТИГЕН) ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО) Комплемента нет - связался с опытной системой.  Без  комплемента гемолиз эритроцитов       невозможен.

 

 

 

Рис. РСК