Умови плр

5 мкл кДНК, 0,2 мл dNTPs, 1X буферу полімерази, що містить 2,5 мл MgCl2, 100 нг кожного праймера, і одиницю виміру Taq ДНК полімерази. Доповнюють 50 мкл дистильованої води. Однак, кількість менше, ніж 1,25 умовних одиниць виміру Taq ДНК полімерази, може завадати виявленню А-вірусу винограду. Тому, краще використовувати саме 1,25 умовних одиниць для реакції для виявлення даного вірусу [27, 43, 45].

Цикли плр

(Тепловий старт: Додати Taq ДНК полімеразу, в той час як як реакція нагрівається до 94ºC): 94ºC протягом 5 хв, потім 5 циклів при 94ºC по 50 сек, 50ºC близько 1 хв, і при 72ºC – 1 хв. Далі 30 циклів при температурі 94ºC протягом 50 сек, 51ºC - 1 хв, і 72ºC – 1 хв. Заключний етапм – при 72ºC - 5 хв.

Після проведення даного дослідження було з’ясовано, що використовуючи метод IC-RT-PCR для виявлення і діагностики А-вірусу винограду ми отримали більш точні результати, чим при використанні методу RTPCR [27, 43, 45].

1.2.3 Біотест

Тестування на індикаторних сортах винограду проводили шляхом щеплення їх методом сухого настільних щеплень на тестовану лозу, стратифікації, висадки в шкілку і обліку протягом трьох років. В якості тест рослин використовували: Vitis rupestris du Lot var St. George, LN - 33, Vitis riparia Gloire de Montpellier, 110 R [62].

1.3 Заходи боротьби та профілактики вірусних захворювань винограду

Заходи боротьби та профілактики вірусних захворювань винограду ґрунтуються на отриманні та розмноженні безвірусного посадкового матеріалу, який використовують для закладання нових насаджень [32, 49, 58]. Потрібно використовувати тільки здоровий посадковий матеріал та знищувати хворі рослини, вести боротьбу з нематодами-переносниками, можна застосовувати біостимулятори для підвищення імунітету рослин. Також, сучасні дані свід­чать про те, що можна використовувати хіміотерапевтичні методи позбавлення від вірусів [26].

Рання сучасна діагностика вірусних захворювань дозволяє швидко визна­чити якість посадкового матеріалу винограду [32, 58]. Одними із найнадійні­ших, найчутливіших і найспецифічніших методів діагностики є серологічні [25, 37, 58] і молекулярно-біологічні [2, 4, 21, 37]. Використання імуноферментного аналізу (ІФА) та полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР) уможливлює за короткий термін проведення скринінгу великої кіль­кості зразків та вивчення поширення збудників вірусних захворювань на вино­градниках [2, 25, 58]. Крім того, існують такі методи діагностики: візуальний, індексація щепленням на індикаторні сорти винограду (симптоми захворювання виявляються впродовж року щеплення, іноді на 2–3-й рік, залежно від виду вірусу), механічні перенесення на трав’янисті індикатори [17, 31, 35, 44]. Хоча, на жаль, вони і не завжди дають достовірні результати, згідно з міжнародними правилами при виробництві сертифікованого посадкового матеріалу винограду їх обов’язково використовують. Це пов’язано з тим, що на винограді можуть з’явитися нові невідомі віруси, які неможливо ідентифікувати за допомогою ІФА та ПЛР.

1.4 Філогенетичні методи діагностики

Молекулярна еволюція як наука включає в себе два напрямки досліджень. Її метою є вивчення закономірностей зміни спадкової інформації в живих системах, включаючи доклітинні і клітинні форми життя, вивчення історії розвитку життя на Землі, встановлення спорідненості між формами життя, їх генетичним матеріалом – філогенії форм життя. Перший напрямок досліджень включає в себе вивчення частоти та інших характеристик еволюційних змін в макромолекулах – нуклеїнових кислотах та білках, а також механізмів та причин, які визначають ці зміни. Друга область досліджень молекулярної еволюції направлена на реконструкцію еволюційного процесу розвитку форм життя на Землі, встановлення родинних зв’язків між формами життя та створення їх еволюційної класифікації, має назву молекулярної філогенетики.

Мінімальний варіант реконструкції філогенезу може бути представлений у вигляді філогенетичного дерева. Переваги філогенетичних дерев полягають в тому, що ці схеми є корисними для зведення таксономічних даних і наочно ілюструють уявлення автора про еволюційну історію даної групи.

Філогенетичний аналіз молекулярних даних є одним із підходів до теоретичного вивчення структури і функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) та їх еволюційного перетворення. Філогенетичний аналіз вивчає еволюційний порядок дивергенції послідовностей генів і білків або їх частин і таким чином відповідає на питання, яким чином пов'язані організми, які стали джерелом отриманих послідовностей. Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких структурою або по функції генів або білків, і, перш за все, порівняння їх первинних послідовностей. Маючи безліч подібних послідовностей можливо відновити еволюційні зв'язки між генами і цілими організмами.

Еволюційні зв'язки ілюструються деревовидною структурою - філогенетичним деревом. В якому вузол – точка розділу предкової послідовності на дві незалежні еволюціонуючі. Гілка – зв'язок між вузлами. Корінь – гіпотетичний загальний предок.

Філогенетичне дерево (еволюційне дерево,дерево життя) - дерево, що відображає еволюційні взаємозв'язки між різними видами, іншими таксонами, генами або іншими об'єктами, що мають загального предка.

Вузол: представляє таксономічну одиницю. Він може бути або існуючою групою або предком.

Гілка: визначає взаємовідношення між таксонами в термінах нащадків і предків.

Довжина гілки: представляє число змін, які відбулися між таксонами.

Корінь: загальний предок всіх організмів, які розглядаються.

Клада: група двох або більше таксонів або послідовностей ДНК, яка включає як свого загального предка, так і всіх його нащадків. [23, 55].