Глава II

МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

В наших исследованиях по изучению биологического действия сверхслабого электромагнитного излучения клеток использован метод биологического детектирования, идея которого йредложена в свое время А. Г. Гурвичем (1945). Наиболее чувствительным детектором слабых излучений, судя по данным А. Г. Гурвича, являются биологические объекты (клетка). Поскольку нас интересовал вопрос, заложена ли сигнальная функция в сверхслабом свечении клеток, необходимо было выбрать такую модель клеточного состояния, которую можно было бы четко учитывать с помощью биологического детектора. С этих позиций наиболее удобный объект — культура ткани, зараженная различными вирусами, пораженная двухлористой ртутью (сулемой) или ультрафиолетовой радиацией (т. е. пораженная каким-либо экстремальным агентом). Учет специфического действия вирусов, сулемы и УФ-радиации можно вести по цитопатическому действию (ЦПД) и иммунологическим сдвигам. Исследования планировались таким образом, что культура ткани, зараженная вирусами, пораженная сулемой или УФ-радиацией, была источником специфического сигнала, закодированного в сверхслабом свечении инфицированных клеток. Детектором этого излучения служила интактпая культура ткани (не пораженная экстремальным агентом). Культура-детектор и пораженная культура полностью разобщались в специальных изолированных камерах с автономной для каждой системы клеток питательной средой. Сохранялся только оптический контакт через кварцевые или обычные стекла-подложки, на которых в камерах росли клетки культуры ткани (фото 1, 2)¹. В клетках интактной культуры (в дальнейшем обозначаемой как «зеркальная» культура ткани), имеющей оптический контакт с пораженной тканью, развивались все морфологические признаки экстремального состояния, специфически присущие соответствующему агенту (в дальнейшем они обозначаются как «зеркальный» цитопа- тический эффект — ЦПЭ).

ВЫБОР КАМЕР

По условиям опыта требовалось вырастить ткань одновременно в нескольких камерах, которые затем соединить попарно дно с дном (см. фото 2). Кроме того, чтобы избежать высыхания и голодания ткани, камеры необходимо было поместить во вращающийся барабан (рис. 1, 2). Культура ткани, служившая объектом исследования, выращивалась в специальных камерах (см. рис. 1), которые представляют собой шарообразный сосуд диаметром 50 мм с патрубком для заливки питательной среды и клеточной взвеси и круглым отверстием диаметром 10 мм со шлифованными краями в дне камеры. После стерилизации камеры к отверстию в дне с шлифованным краем с помощью индифферентной в биологическом отношении пластической массы герметично припаивалось стекло, слюдяная или кварцевая пластинка (15x15 мм, толщиной от 0,2 до 1,0 мм). Затем в камеру через патрубок вносили клеточную взвесь и питательную среду. Камеру закрывали стерильной пробкой и помещали в термостат (37°С) припаянным вниз стеклом на 2—3 сут до получения культуры ткани в виде монослоя на припаянном стекле. После этого культура считалась готовой к эксперименту. Для получения «зеркального» цитопатического эф-

фекта в интактной культуре, отделенной кварцевым стеклом-подложкой от культуры ткани, пораженной экстремальным агентом, использованы три конструкции камер. Ряд опытов проведен с указанными выше шаровидными камерами, но питательной средой заполняли не всю камеру (5 мл), а оставляли около 9/10 объема под свободное воздушное пространство и в неподвижном состоянии подложками вниз выращивали мопослой клеток. При монтировании камер попарно во избежание высыхания и голодания культуры клеток, размещенной подложкой вверх, их помещали в специальный барабан, где ткапь постоянно при медленном вращении омывалась питательной средой, так как положение «верх — низ» менялось дважды за полный оборот барабана. Продольная ось смонтированной пары камер располагалась перпендикулярно оси барабана. В одну из камер вносился экстремальный агент (вирус, сулема, УФ-облучение). ГІроведепа серия экспериментов, позволившая устаповить, что при применении камер описанной конструкции, помещенных во вращающийся барабан, «зеркальный» цитопатический эффект наблюдается в 73—78%.

Кроме того, пас интересовала возможность получения «зеркального» цитопатического действия без помещения камер во вращающийся барабан. Было исследовано несколько типов камер, в которых эффективное выращивание культуры не требовало вращения.

Первая конструкция (фото 3) — камера шарообразная с отведенным сбоку около дна патрубком, к которому припаивалась подложка. В камеру вносили 5 мл питательной среды со взвесью клеток (200—300 тыс. на 1 мл среды). Такая камера не помещалась в барабан для вращения. Над питательпой средой оставался слой воздуха. В таких условиях клетки давали хороший рост на подложке, но «зеркальный» цитопатический эффект отсутствовал даже при контактировании в течение 3—4 сут при наличии в культуре ткани, парной камеры, пораженной вирусом или сулемой выраженного дитопатического эффекта (на 4+).

Вторая конструкция — камеры в виде чашек Карреля, наложенных одна на другую, с впаянным кварцевым или стеклянным дном (фото 4). Камеры не вращались. Исследовано 50 пар камер, из них 40 с кварцевым и 10 пар с простым стеклом. Ни в одном случае «зеркальный» цитопатический эффект не наблюдался.

В качестве вращающегося барабана нами использован аппарат для культивирования тканей во вращающихся пробирках. Мотор аппарата был выпесеп из термостата, в пем находился лишь барабан с укрепленными на нем камерами. На барабан помещалось одновременно до 56 пар камер.

В вирусологической практике отмечено, что наибольший выход вируса в клеточной культуре происходит при росте ткани не в покое, а при медленном ее вращении, когда для клеток происходит постоянная смена питательной среды — кислорода. Нам

неооходимо оыло установить, при какой скорости вращения барабана можно получить оптимальные условия воспроизведения «зеркального» ЦПЭ. Проведены опыты по определению числа оборотов, оптимального для выращивания культуры — по 50 опытов на каждую скорость вращения (12, 20, 24, 25, 28, 30 об/ч). ІІри вращепии барабана со скоростью 12—20 об/ч положительные результаты получены в 17 случаях. Наилуч- тие результаты наблюдали при вращении барабана со скоростью 24—25 об/ч. В этом

	Число пар камер
Скорость вращения барабана, об/ч	всего	с положительным «зеркальным» ЦІІЭ	без «зеркального» ЦПЭ
12	50	15	45
20	50	22	28
24—25	50	40	10
28	50	12	20
	Нес [іецифичес кая дегенерация в 18 парах камер
30	50		50
	ІІеспецифическая дегенерация

случае «зеркальный» ЦПЭ по- лучеп в 40 опытах из 50. В контрольных, незараженпых вирусом культурах, подвергавшихся такому же вращению, неспецифической дегенерации не наблюдалось (табл. 1). При вращении барабана со скоростью 30 об/ч мы наблюдали неспецифическую дегенерацию клеток как в незараженпых (контрольных), так и в зараженных вирусом камерах.

Таким образом, оптимальпым условием культивирования клеток вне организма и воспроизведения «зеркального» ЦПЭ было вращение камер в барабане со скоростью 24—25 об/ч. При такой скорости вращения клетки в колбах равномерно смываются средой без гидродинамического воздействия, не подсыхают, на достаточное время соприкасаются с газовой фазой среды культивации, своевременно смываются с поверхности монослоя продукты метаболизма, тормозящие рост и деление клеток. Все эти моменты отражены в известных руководствах по культивированию клеток вне организма.

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ ТКАНИ И ПІІТАТЕЛЫІОЙ СРЕДЫ

Для проведения эксперимента использовали как первичную, так п перевиваемую гомологичную культуру. Экспериментировали на первичной культуре фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) и фибробластов куриного эмбриона (КЭ), выращенных из трип- синизировапной кожно-мышечной ткани; использовали первично трипсѵтизированную культуру клеток глаза эмбриона человека (ГЭЧ). Кроме того, использовали следующие перевиваемые клеточные линии: Нер-2 — перевиваемые эпителиальные клетки карциномы гортани человека; Неіа — перевиваемая культура кле

ток рака шейки матки человека; ГГЛО — перевиваемая линия клеток паховой железы обезьяны; СІІЭВ — перевиваемый почечпый эпителий эмбриона свипьи; МК — перевиваемая линия клеток почки обезьяны; L — перевиваемая культура мышиных фибробла- стов; FI — перевиваемая линия эпителия амниона человека; ВII— перевиваемая линия клеток почки эмбриона человека; АМН — перевиваемая линия амниона человека.

Культивировали клетки па среде 199 Паркера с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков.

ПОДЛОЖКИ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ В КАМЕРАХ

Проведена серия экспериментов по влиянию толщппы и качества подложки, па которой выращивался монослой тканевой культуры, на условия получения «зеркального» ЦП Д.

В качестве подложки для клеток применялись стекла толщиной 0,2; 0,4; 0,6; 1,0 мм, а также кварцевые и слюдяные пластип- ки толщиной 0,2; 0,4; 0,6; 1,0 мм. Пропускная способность квар-

Таблица 2

Влияние толщины подложки на «зеркальный» ЦПЭ в контактной культуре

Клеточная	Экстремальный	Число	Толщина подложки, мм
культура	агент	опытов	0,2	0,4	0,6 1 1,0

Кварцевая подложка

ФЭЧ	Вирус Коксаки А-13	25	22/3	18/7	17/8	0/25
кэ	FPV	25	18/7 ■	18/7	17/8	0/25
МК	Ad-5	25	16/9	17/8	13/12	0/25
ФЭЧ	Сулема	25	20/5	20/5	18/7	0/25

Слюдяная подложка

ФЭЧ	Вирус Коксаки А-13	25	22/3	16/9	18/7
Пер-2	Ad-5	25	21/4	20/5	12/13
ФЭЧ	УФ-радиацші	50	46/4	36/34	30/20

Стеклянная псдложпа

ФЭЧ	Вирус Коксаки А-13	25	0/25	0/25	0/25	0/25
кэ	FPV	25	0/25	0/25	0/25	0/25
МК	Ad-b	25	0/25	0/25	0/25	0/25
ФЭЧ	Сулема	25	0/25	0/25	0/25	0/25

Примечание. В числителе — число положительных опытов, в знаменателе — число отрицательных опытов.

дсвых пластинок в области 220—360 нм равнялось 70—90%, а слюды — 80—95 %. Для простых стекол область пропускания находилась в видимой части спектра, начиная с 380—440 нм.

Припаивалось стекло термопластической массой В-12. В этих опытах получены следующие результаты: при толщине кварцевого стекла 0,2; 0,4 и 0,6 мм со всеми экстремальными агентами в 17—20 случаях из 25 на каждый экстремальный агент наблюдался «зеркальный» ЦГІО. При использовании кварцевой или слюдяной подложки толщиной 1,0 мм «зеркальный» Ц11Э не наблюдался (табл. 2). При постановке опыта с простым стеклом любой толщины в качестве подложки «зеркальный» ЦГІЭ в интактной культуре не получен пи разу, ни с одним из экстремальных агентов (см. табл. 2).

Таким образом, толщина кварцевой или слюдяной подложки от 0,2 до 0,6 мм позволила получить «зеркальный» ЦПЭ в интактной культуре в парных камерах. При толщине подложки 1,0 мм (для пары камер 2,0 мм) «зеркальный» ЦПЭ исчезал. При использовании стеклянных подложек любой толщины он не проявлялся (см. табл. 2).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСПОЗИЦИИ КОНТАКТА КАМЕР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ «ЗЕРКАЛЬНОГО» ЦПЭ

Для определения минимальной эффективной экспозиции контактирования зараженных и незараженных клеточных культур в парных камерах, необходимой для проявления «зеркального» ЦПД, стыкованные камеры с пораженной и непораженной клеточной культурой разъединяли через определенные промежутки времени (2, 4, 6, 12, 24, 48 ч) с дальнейшим наблюдением за морфологическими характеристиками культуры ткани в «зеркальных» камерах.

Исследовано по 50 пар камер каждой экспозиции при воздействии различных экстремальных агентов. Эксперимент проводился одновременно с двумя парами камер, время экспозиции которых было одинаково, так же как и все прочие условия.

Одну пару камер разъединяли через 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 ч контакта, затем зараженную «зеркальную» и клеточные культуры помещали отдельно в разные термостаты. Демонтирование камер, фиксирование, окраску и морфологические исследования стекол проводили через 18, 24, 48 ч раздельного культивирования. Оказалось, что минимальное время контакта, необходимое для появления «зеркального» Ц11Э, равно 4 ч для вируса FPV и 6 ч для аденовируса, вируса Коксаки А-13 и сулемы. Более короткая экспозиция четкого эффекта не дает. «Зеркальный» эффект при

4. 6-часовой экспозиции проявляется лишь через 18—20 ч раздельного культивирования (табл. 3).

Таблица 3

Влияние экспозиции коптактиронания камер на проявление «зеркального» ЦПЭ в интактной клеточной культуре

Клеточная культура	Экстремальный агент	Время экспозиции, ч
		2	/,	°	8	12		48
ФЭЧ	Вирус Коксаки Л-13			“Г	. -	-г	"I"
кэ	FPV	—		'Г	J-	"Г	‘ і '	+
мк	Ad- 5	—		__		~L	-r	-Г
ФЭЧ	Сулема	—		' і"	_J_	+		-1-

Примечание. Во всех сериях экспериментов по 50 пар камер.

Вторую пару демонтировали после окончания оптимального времени экспозиции (48 ч). Подложки фиксировали, красили гематоксилин-эозином для морфологического исследования. Культуральную жидкость отбирали для выявления вируса при пассаже на культуре ткани как из зараженной, так и «зеркальпой» камеры. При контакте камер в течение 48 ч «зеркальный» ЦПЭ проявлялся в 35—40 парах камер из 50.

В процессе работы выяснилось, что получение положительного «зеркального» эффекта зависит от некоторых дополнительных условий. Так, от начала до конца опытов в термостате выдерживается полная темнота: открывание термостата во время опыта, а следовательно засвечивание культур рассеянным неярким светом, резко снижает или полностью уничтожает положительный «зеркальный» ЦПЭ. Для выяснения возможной причины указанного явления засвечивания зараженные и незараженные культуры исследованы на специальной квантометрической установке высокой чувствительности (с помощью ФЭУ-42). В опытах с предварительным освещением тканевых культур дневным светом установлено наличие длительного (1,5—2 ч) вторичного свечения. По-видимому, этот эффект является одной из причин отсутствия «зеркального» эффекта в опытах с засвеченными камерами: появление дополнительных; «световых» шумов гасит эффект взаимодействия в системе клетка — клетка.

ОБЩАЯ СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Опыт проводился в парных камерах. После того, как на подложке образовывался монослой клеток, в одну камеру вносился какой-нибудь из указанных выше экстремальных агентов, другая оставалась нетронутой. Затем камеры с внесенным повреждающим

фактором монтировались попарно с интактными камерами доньями-подложками (см. рис. 2) и закреплялись на барабане перпендикулярно оси (см. рис. 5). Барабан находился внутри затемненного термостата (t -- 37°С) и вращался вместе с камерами со скоростью 25 об/ч. Таким образом, в каждый определенный момент времени клетки в обеих камерах равномерно омывались питательной средой, а следовательно, не подсыхали и ие голодали (см. рис. 3, 4).

Оптимальность условий культивирования клеток проверялась по интактпой ткани в аналогичных камерах без обработки, кроме попарного монтирования. Такой контроль на выявление спонтанной дегенерации клеток культуры ткани постоянно сопровождал все оныты. Спонтанная дегенерация не наблюдалась.

Через несколько суток камеры извлекались, демонтировались, стекла-нодложки с выросшими на них клетками отпаивались и после фиксации и окрашивания проводили морфологическое исследование культуры. Препараты фиксировали метиловым спиртом или 10%-ным формалином, окрашивали по Романовскому, по Браше гематоксилин-эозином.

Учет цитопатического эффекта вели по отношению числа погибших клеток к числу всех клеток и по типу морфологических изменений. Слабоположительный цитопатический эффект оценивали отношением 1 : 10, средний — 1 : 2, выраженный — 2: 3-1:1.

В качестве экстремального агента в работе использовали три различных вида вируса: Коксаки А-13 (штамм 401 и 639)вирус классической чумы птиц и аденовирус (штамм 5); химический клеточный яд — двухлористую ртуть (сулему) и ультрафиолетовую радиацию (экспозиция 40—45 с,_: лампа БУВ-30, расстояние

0. 5 м), т. е. исследовалась зависимость проявления дистантных межклеточных взаимодействий нріі воздействии на клеточную культуру факторами биологической и физической природы.