Глава IV

ЭЛЕКТРОМАГНИТНАЯ ПРИРОДА ДИСТАНТНЫХ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Как показали результаты проведенных нами исследований по дистантным межклеточным взаимодействиям, взаимодействие клеток в двух клеточных системах, по-видимому, не осуществляется химическим путем через питательную среду, так как все камеры как с положительными, так и с отрицательными эффектами были стерильпы, т. е. возможность заражения или какая-либо биохимическая связь по условиям опыта полностью исключается. Как уже говорилось, «зеркальный» ЦПЭ наблюдался в случае применения в качестве подложки кварцевых или слюдяных пластинок. Стеклянные подложки не эффективны. Отсюда следует, что носителем сигпала при взаимодействии двух клеточных систем могут быть излучения УФ- или ИІ\-диапазона, так как кварц прозрачен и по отношению к ИК-излучению [Ко- зелкин, Усольцев, 1967]. Такая точка зрения подтверждается следующими фактами.

Были проведены исследования как в полной темноте, так и при освещении. Полученные данные свидетельствуют о том, что при освещении культур даже рассеянным дневным или электрическим светом эффект взаимодействия не проявляется. Измерения, произведенные с помощью ФЭУ-42, показали, что клетки, предварительно находившиеся на свету (в отличие от клеток, находящихся в темном термостате), длительное время (более часа) интенсивно высвечивают в видимой области спектра. Этот всплеск индуцированного светом излучения может рассматриваться как шум относительно собственного слабого сигнала.

В исследованиях с применением металлической фольги или черного фильтра между камерами получен отрицательный результат, т. е. отсутствие «зеркального» эффекта.

Взаимодействие осуществляется на достаточно большом расстоянии, разделяющем две культуры друг от друга. По мере разнесения культур, а также при постоянном утолщении кварцевых и слюдяных подложек эффективность дистантного взаимодействия клеток падает, это можно объяснить поглощением электромагнитного излучения оптической средой, расположенной между двумя культурами, и малой интенсивностью излучения, испускаемого клетками.

Выясняя механизм дистантных межклеточных взаимодействий в системе двух клеточных культур, мы провели исследования зависимости проявления «зеркального» ЦПЭ от количества клеток в монослое детектора и индуктора и дозы экстремального агента, вызывающего поражение клеток в культуре-индукторе. Излуча- тельный характер связи между клетками подтверждается зависимостью «зеркального» эффекта от соотношения клеток «источников» и «приемников» излучения.

Исследования проводились в несколько этапов. В первом случае исследовалась зависимость проявления «зеркального» эффекта от соотношения «биомасса индуктора» — «биомасса детектора». Под словом «биомасса» мы подразумеваем количество клеток в монослое, взятых в эксперименте.

Для эффективного роста различных клеточных культур концентрация засеваемых клеток различна и зависит от потенции размножения данной линии клеток. Концентрация клеток в засеваемой суспензии определяет жизнеспособность, деление и рост клеток при искусственном культивировапии. Если концентрация мала, то клетки погибают, так как для их жизни вне организма необходимо некоторое количество питательных и стимулирующих веществ, выработка которых может быть обеспечена только клеточным комплексом [Иберт, 1968].

Существенной чертой взаимодействия клеток в культурах является подавление подвижности и митотической активности клеток при достижении определенной плотности популяции [Ро- бертис, 1973]. Торможение размножения после образования монослоя связано с клеточными контактами (контактное торможение).

В результате торможения подвижности и установления прочных контактов между клетками монослой превращается в единую систему, где состояние каждой отдельной клетки достаточно стабильно [Васильев, 1965].

Факторы, регулирующие рост, передаются через клетки, а пе через среду: высокая проницаемость между клетками превращает весь пласт в функционально единый комплекс, в котором свойства отдельных клеток усредняются. Поэтому функциональное объединение очень резко стабилизирует условия существования клеток. Если в такой единой системе появляются, например, отдельные мутантные клетки с резко измененным метаболизмом, то из-за усреднения в пласте эти свойства могут не проявиться ІЗалкинд, 1953].

Исследования проводили на монослое с различным количеством клеток в нем (так называемый плотный и разреженный монослой) и в культурах ткани 1ГАО (клетки паховой железы обезьяны) и 14 (клетки амниона).

Клеточную культуру выращивали в камерах, где в качестве подложки применяли кварцевые стекла. Питательная среда состояла из среды 199 с добавлением в нее 10% бычьей сыворотки.

Для нолучепия однослойной клеточной культуры использовали минимальную концентрацию засеваемой суспензии (5-10⁴— 6-10⁴ клеток па 1 мл инкубациоппой среды), при которой происходит формирование жизнеспособного клеточного монослоя —

Таблица 32 Плотность роста монослоя (S_р) в клеточных культурах при различных количествах засеваемых клеток

Концен трация клеток, тыс/мл	Площадь клеточного монослоя, %
	FI	ПАО
50	24±3,14	42+3,28
60	40±1,2	56,4±5,52
70	64±6,3	80+5,44
80	88+2,0	98±2,1
100	96+3,4	100
120	100	—

так называемого разреженного монослоя, где клетки образуют отдельные группы по 3—10 шт. Для образования так называемого плотного монослоя исиользовали максимальную концентрацию клеток (8-10⁴— 1,2* 10⁵ клеток на 1 мл инкубационной среды), дающую сплошной мопослой, в котором каждая клетка со всех стороп окружена другими и образует с ними прочные контакты.

Для определения плотности монослоя любой из указанных клеточных линий проведена серия посадок взвеси с опре

деленной концентрацией клеток па покровные стекла (табл. 32).

Формирование жизнеспособного монослоя в клеточной культуре ІІЛО наблюдается при концентрации 50 тыс./мл (42% площади препарата занято клетками), а для культуры клеток FI — 60 тыс./мл (46% площади занято клетками). С увеличением концентрации клеток происходит зарастание всей площади подложки.

Максимальная концентрация клеток, образующая плотный монослой (100%) площади препарата занято клетками): для ГІЛО — 100 тыс./мл, для FI — 120 тыс./.мл. При дальнейшем увеличении пороговой концентрации наблюдается образование сплошного слоя клеток с многослойными участками.

Изучая зависимость проявления «зеркального» ЦПЭ от количества клеток в монослое, одну из клеточных культур с плотным или разреженным монослоем (в зависимости от условия опыта) подвергали воздействию экстремального агента, другая служила детектором излучения, отражающего цитопатические изменения, возникающие в пораженных клетках — «зеркальная» культура. Экстремальным агентом применяли двухлористую ртуть в концентрации 5 мкг/мл и ультрафиолетовое облучение (экспозиция 40—45 с; лампа БУВ-30, расстояние 0,5 м).

Токсическая доза сулемы вследствие блокады дыхательных ферментов приводит к гибели клеток культуры ткани. Развивается цитопатический эффект, который выражается в дезинтеграции монослоя, зернистой и вакуольной дистрофии клеток и ка- рионикнозе. Процесс завершается гибелью всего монослоя.

При действии сублеталыюй дозы УФ-облучения (40—45 с) гибель или выживание клеток обнаруживается не сразу, а в отдаленные от облучения сроки. Прежде чем погибнуть, клетки успевают несколько раз разделиться, затем длительное время не делятся и, наконец, погибают [Самойлова, 1967]. Цитопатический эффект в данном случае выражается в дискомплексации клеточного пласта, наличии пикнотических изменений и дегене- рироваппых клеток.

Исследования сопровождались несколькими контролями.

1. Контроль на наличие «зеркального» цитопатического эффекта при оптимальных условиях: концентрация засеваемой суспензии для образования монослоя-ипдуктора и монослоя- детектора равнялась 80 тыс. клеток в 1 мл питательной среды.

2. Контроль на выявление спонтанной дегенерации в клеточных культурах; незараженные клеточные культуры с разреженным и плотным монослоем монтировали попарно и помещали в термостат вместе с опытными, через 48 ч стекла-подложки окрашивали и просматривали па наличие неспецифической спонтанной дегенерации.

3. Кроме того, проводился контроль условий опыта, когда вместо кварцевой подложки использовали простое стекло.

Наличие «зеркального» цитопатического эффекта определяли по отношению числа погибших клеток к числу всех клеток и по

Проявление феномена ДМ В между клеточной куль- турой-индуктором с разреженным монослоем, пораженным экстремальным агентом, и культурой- детектором с плотным монослоем

Экстремальный агент	Число поставленных опытов
	всего	с «зер- кальным» ЦГІЭ	без «зеркального» ЦПЭ
УФ-облучение	54	5	4
Сулема	56	14	42
Без экстремального
агента	56	0	56

типу морфологических изменений поело двухсуточного оптического контакта культур.

Для исследования проявления «зеркальпого» цитопатического эффекта в системе двух тканевых культур в зависимости от количества клеток в монослое проведено две серии экспериментов, в которых онределепа эффективность проявления «зеркального» цитопатического эффекта при использовании в качестве индуктора клеточной культуры с разреженным монослоем, а в качестве детектора — культуры с плотным монослоем (табл. 33).

Исследована степень проявления «зеркального» ЦНЭ при использовании в качестве индуктора культуры с плотным монослоем. Детектором излучения в данном случае служила незараженная культура с разреженным монослоем (табл. 34).'

В нервом случае (см. табл. 33) клеточная культура с разреженным монослоем, зараженная экстремальным агентом, являлась источником излучения, детектором этого излучения служила интактная гомологичная культура с нлотньш монослоем. В клетках такой культуры, имеющей с пораженной культурой оптический контакт, «зеркальный» цитопатический эффект наблюдали

Таблица 34

Проявление феномена ДМ В между клеточной культу- рой-индуктором с плотным монослоем, пораженным экстремальным агентом, и культурой-детектором с разреженный моно слоем

Экстремальный агент	Число поставленных опытов
	всего	с «зеркальным» ЦПЭ	без «зеркального» ЦПЭ
УФ-облучение	54	29	25
Сулема	57	32	25
Без экстремального
агента	56	0	56

в 17% случаев (из 110 поставленных экспериментов — в 19).

Во втором случае (с.м. табл. 34) при оптическом контакте клеточной культуры с плотным монослоем, пораженной экстремальным агентом и интактной гомологичной культурой-детектором с разреженным монослоем, в последней развивается «зеркальный» ЦІІЭ в 55% случаев (из 110 поставленных экспериментов «зеркальный» ЦПЭ наблюдали в G1 эксперименте).

При проведении контроля на наличие «зеркального» ЦГІЭ при оптимальных условиях (мопослой-иыдуктор и монослой-детектор одинаковы) «зеркальный» ЦГ1Э наблюдается в 72—80% случаев.

Проведенные эксперименты показали, что в развитии «зеркального» цитоиатического эффекта большую роль играет количество пораженных клеток, испускающих излучение, и количество клеток, воспринимающих это излучение: чем больше пораженных клеток, иснускающих излучение, тем эффективней воспроизводится «зеркальный» ЦПЭ. Г1о-видимому, для развития «зеркального» ЦПЭ необходима некоторая пороговая интенсивность излучения.

«Зеркальная» культура с разреженным монослоем менее устойчива к излучению от первично пораженных клеток, так как в ней клетки монослоя разобщены между собой, а в удельном отношении на каждую клетку такой культуры приходится большая доза излучения.

Клеточная «зеркальная» культура с плотным монослоем, в котором клетки образуют прочные контакты, ведет себя как единая система, где состояние каждой клетки и мопослоя более устойчиво. Данная клеточная культура представляет собой функционально единый комплекс, в котором свойства отдельных клеток усредняются. Отсюда ее устойчивость относительно любого воздействия индуктора.

Ранее нами показано, что при внесении в культуру ткани натогенного вируса в культуре, находящейся с первой только в оптическом контакте, развивается «зеркальный» цитопатический эффект, характерный для ЦПЭ, обусловленного соответствующим вирусом.

Исследуя зависимость проявления «зеркального» ЦПЭ ог различной дозы вируса, мы использовали первично трипсини- зированныо клетки куриного эмбриона и вирус классической чумы птиц в титре от 10^_І до 10~^G и аденовирус 5-го типа в тех же титрах на перевиваемой линии клеток Нер-2 и первично трипсинизирован- ных клетках человеческого эмбриона. Вирус вносился вкамерусвы- росшей^суточной культурой клеток в определенном заданном титре. После этого зараженные камеры соединялись попарно с незара- женными и помещались в термостат при температуре 37,2° на 2— 3 сут. Через 2 сут камеры демонтировали, стекла-подложки после фиксации и окрашивания выращенных клеток подвергали морфологическому исследованию.

Все исследования с различными титрами указанных вирусов сопровождались контрольными экспериментами: параллельно

Зависимость проявления «зеркального» ЦІІЭ от титра вируса, взятого

в эксперименте, %

Вид т/гагаі	Вирус			Титр вируса
		10~]	ю-2	10~3	10 4	10 5	10 6
КЭ	FPV	0	10-20	70	70	40-50	20
Нер-2	Ad-b	0	20	73	70	30	20

Примечание. Всего проведено по 100 экспериментов с каждым титром вируса.

с опытными парами камер, одна из которых заражена вирусом, в термостат помещались пары камер, не зараженные вирусом (для выявления спонтанной дегенерации). Проводилось пассирование культуральной жидкости из зараженных и незаражениых камер: вирус выделялся только из зараженных камер, в незаражениых камерах, как в «зеркальпых», так и в контрольных, в трех последовательных пассажах вирус не обнаруживался.

При постановке реакции гемагглютинации (FPV) с культуральной жидкостью из зараженной камеры гемагглютипипы обнаружены в титре 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160. Культуральная жидкость из незаражениых «зеркальных» камер положительной реакции гемагглютинации не давала, что свидетельствует об отсутствии вируса.

В первой серии опытов с вирусами классической чумы птиц и тканью КЭ после внесения вируса в титре 10^_1 наступал ранний цитопатический эффект, который наблюдается при массивной инфекций в чувствительных клетках, ЦПЭ развивается через 8—12 ч, «зеркальный» ЦГІЭ при этом не успевает проявиться. В силу этих же причин при исследовании с титром 10~² положительный «зеркальный» ЦПЭ получен в 20% случаев. При внесении вируса в титре 10~³ и 10^-4, когда ЦПЭ развивался в течение 2—

3. сут, «зеркальный» Ц11Э наблюдался в 70% и более случаев. При исследованиях с титром вируса 10^-5 и 10^-G ЦІІЭ не всегда проявляется в зараженной камере, и в зависимости от этого падает и процент проявления феномена ДМВ. Такая же картина наблюдается при исследованиях с аденовирусом 5-го тина на тканях ФЭЧ и Нер-2 (табл. 35).

Нами получена определенная корреляция между дозой вируса, взятого в эксперимент, степенью выраженности вирусного ЦПЭ и частотой положительпого «зеркального» эффекта. Установлено, что максимальный процент положительного «зеркального» цитопатического эффекта в опытах с вирусом куриной чумы птиц и аденовируса 5-го типа получен при внесении вируса в культуру ткани в титре 10~³ и 10^-4. Эта концентрация вируса оптимальна для изучения дистантных межклеточных взаимодействий, осуществляемых в системе клетка — клетка. При заражепии клеточной культуры низким титром вируса (титр 10^-4—10~⁸) вирусное

ЦПЭ проявляется пе во всех камерах индуктора, и в то же время в камерах с проявившимся ЦІ7Э не все клетки поражены вирусом, в этом случае мы имеем или отрицательный результат, или слабо положительный «зеркальный» ЦПЭ. При заражении массивными дозами вируса клеток индуктора клеточный монослой очень быстро погибает: здесь играет роль и токсический эффект вируса; при этом излучение индуктора, на наш взгляд, не успевает сформировать «зеркальный» ЦПЭ в клетках детектора, поэтому при заражении камеры индуктора вирусом в титре 10^-1 и 10^-2 излучение клеток (или часть его) может быть неспецифическим (типа «некробиотических» или «деградациониых» лучей). Этим можно объяснить то, что при использовании вируса в титре 10^-1 нами получен отрицательный результат, а в титре 10^-2 — очень низкий процент проявления «зеркального» ЦІІЭ (10—20). Это еще раз свидетельствует о том, что при оптимальной дозе экстремального агента проявление «зеркального» ЦПД есть результат длительного и сложного дистантного действия излучения пораженных клеток индуктора на клетки детектора и в описываемом явлении электромагнитного взаимодействия клеток излучению нельзя приписать роль «пускового» или энергетического фактора, так как по меньшей мере сомнительно существование нреформиронаи- ной генетической программы поражения клеток различными внешними воздействиями: вирусом, токсическими факторами, УФ- радиацией и т. д.

Для проявления «зеркального» эффекта требуется достаточно длительный период контакта культур детектора и индуктора, причем длительность зависит от природы экстремального агента. Например, для вируса классической чумы птиц FPV — не менее

3. ч. а для вируса Коксаки А-13 — не менее 6 ч. Это свидетельствует о том, что электромагнитное излучение культуры индуктора оказывает длительное специфическое воздействие, организуя и контролируя процесс «зеркального» поражения клеток культуры- детектора.

Зависимость проявления «зеркального» эффекта от дозы экстремального агента и соотношения «биомассы» индуктора и детектора позволяет представить два клеточных монослоя (с автономным жизнеобеспечением, но имеющих оптический контакт через слюдяные или кварцевые «окоіпки») как взаимодействующие системы источников электромагнитного излучения (культура- индуктор) и приемников его (культура-детектор).

Использование биологического детектора излучения клеток позволяет решать вопросы о биологической эффективности, специфичности, универсальности изучаемого явления дистантных межклеточных взаимодействий. Для количественного исследования феномена, т. е. для того чтобы определить, хотя бы приблизительно, интенсивность и спектральный состав излучения, необходимо применение физических способов обнаружения излучения биосистем.

Еще в 30-х годах нашего столетия В. Леыешкин [Lepeschkin, 19331 сообщил о том, что им обнаружено очень слабое излучение в области ультрафиолета, которое он открыл, применяя специальные фотонластиики с низким содержанием желатина (пластинки Шумана). Наблюдая засветку и потемнение фотоматериалов, он обнаружил, что отмирание клеток приводит к высвобождению энергии, запасенной в биологических структурах, в виде излучения в ультрафиолетовой области.

Наличие подобного свечения подтверждено в опытах с отмирающими тканями печени, мышц, нервов в работе М. Ситко [Журавлев, 1965].

Регистрация излучения с помощью фотографической пластинки связана с некоторыми неудобствами получения количественных результатов измерения, обусловленными нелинейной зависимостью числа проявленных зерен от освещенности фотопластинки и необходимостью использования дополнительной аппаратуры для измерения степени почернения последней.

Принцип действия фотоэлектрических детекторов основан на фотоэффекте. В видимой и ультрафиолетовой областях снектра в основном применяются детекторы с внешним фотоэффектом: фотоэлементы, фотоэлектронные умножители, газонаполненные фотоэлементы (счетчики фотонов); реже — детекторы с внутренним фотоэффектом: полупроводниковые фото и фотонарамегрические диоды.

Фотоэлектрические детекторы позволяют непосредственно измерять интенсивность светового потока и дают возможность автоматизировать процесс измерения.

Использование фотоэлементов для" регистрации сверхслабых световых потоков связано с необходимостью применения электронного усилителя с большим коэффициентом усиления. В этом случае шумы нагрузочного сопротивления ограничивают пороговое значение измеряемого светового потока, так как они усиливаются электронным усилителем с большим коэффициентом усиления.

jp» Первые удачные ноиытки обнаружения излучения клеток методом фотоэлектрического эффекта предприняты В. Раевским iRaiewsky, 1931], который применил видоизмененный счетчик Гейгера — Мюллера (Fischer, 19791. На основании своих результатов В. Раевский оценивает интенсивность излучения биообъектов (корешки лука, карцинома мыши) приблизительно в 10^-10— 10~⁹ эрг/см²-с, что соответствует 100 —200 квантам. Тогда же, используя аналогичный аппарат, Г. М. Франк и С. Ф. Родионов регистрировали до 10³ квантов электромагнитного излучения биообъектов. В то же время Г. Бартом (1937) и М. В. Филипповым (1937) в ряде случаев получен отрицательный эффект. И все же, применяя счетчики фотонов высокой чувствительности, исследователям удалось обнаружить очень слабое излучение биосистем [Addubert, 1939; Свешников, 1955; Хайкин, Абаулин, 1955].

В 1961 г. II. А. Троицким, С. В. Коневым, М. А. Катибнико- вым зарегистрировано излучение (в УФ-области спектра) целого ряда биологических объектов с помощью счетной ионизационной трубки типа гейгеровской, снабженной окошком из оптического кварца и платиновым фотокатодом, нри этом интенсивность излучения объекта на 20—60% превышала уровень шума.

Газонаполненные фотоэлементы (счетчики фотонов) по принципу действия ничем не отличаются от счетчиков Гейгера. Основным недостатком детекторов подобного типа является низкая помехозащищенность от разрядов, обусловленных действием космических лучей и других ионизирующих излучений, а также саморазрядка в результате термоэлектронной эмиссии катода. Кроме того, они мало стабильны.

Реальная возможность измерения очень слабых световых потоков стала возможной только с появлением фотоумножителей, изобретенных у нас Л. А. Кубецким, которые с течением времени достигли достаточно высокого совершенства [Чечик и др., 1957; и др. ]. Усиление фототока благодаря вторичной эмиссии и наличие обычно не менее десяти каскадов усиления дают возможность достигнуть порога чувствительности до 10~¹³—10^-14 лм. Кроме того, они пригодны ддя измерения быстроменяющихся процессов. Шумы нагрузочного сопротивления несущественны, поскольку усиление сигнала происходит внутри самого приемника. Коэффициент усиления ФЭУ достигает величины 10^в—10⁷.

В подавляющем числе современных конструкций ФЭУ применяют полупрозрачные катоды, напыленные на внутреннюю торцевую сторону цилиндрического стеклянного баллона. Существует несколько типов фотокатодов с различной спектральной чувствительностью, например: сурьмяно-цезиевый катод (спектральная чувствительность 200 -г- 630 нм; max 250 мм; квантовый выход 20%, чувствительность 30—100 ца/лм); катод покрыт висмут- кислород-сурьмяно-цезием; его спектральная чувствительность 300 730 нм; квантовый выход гораздо ниже; чувствительность фотоэлемента 10—60 ца/лм; цезиевый катод, квантовый выход которого имеет самое низкое значение, спектральная чувствительность 350-Г-1200 нм, чувствительность фотоэлемента 10—60 ца/лм и др.

Одним из факторов, отрицательно влияющих на регистрацию сверхслабых световых потоков, является наличие у ФЭУ темпового тока, основной вклад в который вносит термоэмиссия катода, поэтому для снижения этого тока применяют специальные системы охлаждения. Однако при работе с живыми объектами охлаждение не всегда целесообразно, поэтому часто применяют различные автоматические устройства типа реверсивных счетчиков, вычитающие средний уровень «шума» из суммы «сигнал -f-шум», или используются преимущественно ФЭУ с низким уровнем шумов.

Электромагнитное излучение, сопровождающее метаболические процессы в норме и патологии, происходящие в живой клетке, имеет чрезвычайно малую интенсивность — от 10 до 1000 квантов — и задача его надежной, объективной регистрации, выделе- пие полезного сигнала из массы случайных явлений, с технической точки зрения весьма сложна, но разрешима.

В ряде работ [Баренбойм, Доманский, 1969; Тарусов, Дос- коч, 1971; Туроверов, Мамедов, 1971; и др. ] исследовалось влияние различных факторов на характер сверхслабого излучения растительных и животных клеток. Опыты показали, что характер изменения объектов после воздействия различных факторов оказался более или менее однообразным, и его можно свести к трем формам кинетических кривых, которые приведены в работах Мамедова (1970).

Наиболее часто, сразу после воздействия на клетку, наблюдается резкое увеличение интенсивности излучения до максимума и сравнительно медленное снижение. Высота ника и скорость спада кривой зависят от характера раздражителя и дозы. Такие изменения вызывают большинство использованных физических факторов, наркотики, детергенты, органические растворители и другие повреждающие агенты.

Вторая форма проявления световой реакции клетки на раздражение характеризуется медленным нарастанием интенсивности, а затем медленным снижением ее. К этой группе факторов относятся низкомолекулярные сахара, некоторые красители и осмотическое давление.

И наконец, третья форма световой реакции характеризуется снижением свечения биообъекта. Таким действием обладают соли тяжелых металлов, метаболические ингибиторы и яды, антиоксиданты и некоторые другие вещества [Мамедов, 1970].

При исследовании хемшпоминесценции озимых злаков, зараженных вирусом, отмечено заметное ослабление интенсивности по сравнению с контрольными опытами. Наиболее контрастна эта зависимость на поздних стадиях развития растения [Дубоносов и др., 1971].

Следует отметить, что приведенные характерные формы изменения свечения биосистем при действии различных раздраяш- телей не являются строго специфическими по отношению к определенным раздражителям. Для одного и того же раздражителя в зависимости от дозы и длительности действия форма ответной реакции свечения клеток может меняться.

Было найдено [Мамедов, 1970, 1971; и др.], что изменение интенсивности биохемилюминесцеіщии прямо пропорционально дозе действующего фактора до тех нор, пока эта доза не станет критической для жизнедеятельности организма, в этом случае наступает резкое изменение интенсивности свечения.

Наши исследования культуры ткани, зараженной вирусами, с помощью фотоэлектронного умножителя преследовали цель выявления кинетических закономерностей электромагнитного излучения системы вирус — клетка, которые, возможно, могли бы объяснить этапность развития «зеркалытого» цитопатического эффекта.

Пас интересовал вопрос о том, какую информацию в виде электромагнитного излучения от клеточного монослон, индуктора, пораженного экстремальным агентом (различные виды вирусов), получают клетки детектора. Была предпринята попытка зарегистрировать электромагнитное излучение от клеток индуктора с помощью физического детектора фотоэлектронного умножителя. Для этого мы исиользовали ФЭУ-39 со спектральной чувствительностью в диапазоне 220—650 нм (max 390 нм) и катодной чувствительностью 70 ца/лм. Термостатированную кювету помещали на расстоянии 1 см от фотокатода. Выделение полезного сигнала из посторонних шумов проводилось путем прерывания светового потока и синхронного вычитаыия шума. Разность [(сигнал -f- -}- шум)—(шум)], равная чистому сигналу, регистрировалась самопишущим прибором.

Данные измерения статистически обрабатывали, определяя границы доверительных интервалов. Были построены кривые изменения интенсивности излучения для каждого эксперимента. Затем строились усредненные графики (по о экспериментам) для каждого типа культур и вирусов.

Для учета спонтанного излучения установки и среды, в которой находились клетки, перед началом каждого эксперимента регистрировали излучение среды 199, что служило контролем интенсивности фона.

Для проведения экспериментов использовали первичные культуры ткани — фибробласты эмбриона человека и куриных эмбрионов и перевиваемая линия Х-клетки мыпганых фибробластов. Ткань выращивалась в виде монослоя в стеклянных матрасах.

За 40 мин до проведения эксперимента ростовая среда сливалась и клеточный монослой снимался со стекла раствором вер- сена. Образующаяся суспензия центрифугировалась, затем клетки разбавлялись средой 199 до концентрации 1,5—2 млн./мл. Исследовали линии клеток, чувствительные и нечувствительные к экстремальному агенту.

В качестве экстремальных агентов использовали аденовирусы (типы 5 и 23), адаптированные соответственно к Х-клеткам и культуре ФЭЧ, а также вирус классической чумы птиц, адаптированный к КЭ. Заражение производилось непосредственно в кювете квантометра: соединялся 1 мл суснензии, содержащей 1,5—

2. млн. клеток и 1 мл среды 199, с вирусом в титре 10^-4. Регистрация излучения начиналась через 1—2 мин после заражения. Вся подготовка к опыту шла в затемненной комнате. Параллельно ставился биологический контроль на развитие вируса в клеточной культуре в чашке Карреля, который просматривался в часы квантометрии на проявление цитопатического эффекта как с чувствительными, так и с нечувствительными клеточными

Рис. 3. Изменение интенсивности излучения системы вирус —

клетка:

1 — культура куриных эмбрионов, зараженных вирусом классической чумы птиц; 2 — культура фнбробластов эмбриона человека, зараженная аденовирусом 23-го тшіа; 3 — культура мышиных фнбробластов, зараженная аденовирусом 5-го типа; 4 — уровень фона.

линиями, зараженными вирусом классической чумы птиц и аденовирусом (типы 5 и 23). Одновременно проводились эксперименты по получению «зеркального» ЦІ7Э в камерах биологического детектора.

В результате регистрации электромагнитного излучения чувствительных клеток, зараженных вирусом FPV или аденовирусом (типы 5, 23), мы получили характерное изменение интенсивности излучения системы вирус — клетка, которое представлено на усредненных графиках для каждого вида культур типа вирусов (рис. 3).

В опытах же с нечувствительной к вирусу классической чумы птиц (FPV) клеточной линией мышиных фнбробластов характер изменения интенсивности излучения, с достоверностью 95%, не отличается от излучения, регистрируемого от линии L-клеток, не зараженных вирусом, взятой нами в качестве контроля (рис. 4).

В контрольной серии экспериментов регистрировали излучение среды 199, содержащей вирус; среда 199 без вируса; пустая чистая кювета квантометра и взвесь клеток без вируса. Взвесь клеток излучает кванты электромагнитного поля, интенсивность которых монотонно убывает в 2—3 раза. Зарегистрированное изменение интенсивности излучения каждого вида культур представлено на рис. 5.

Интенсивность излучения суспепзии вирусов среды 199 и кюветы не изменялась в течение 10—12 ч и варьировала от опыта к опыту от 5 до 20 имп/с. Это значение рассматривалось нами как фон.

Интенсивность излучения в контрольной группе несколько изменялась от опыта к опыту, но существенного отличия за 6—10 ч

регистрации не наблюдалось. Для всех исследованных культур характерно монотонное убывание интенсивности излучения клеток.

Излучение суспензии клеток, зараженных чувствительным к ним вирусом, имеет ярко выраженный характер: в течение первых 40—60 мин контактирования клеток с вирусом интенсивность излучения на 100—400% выше, чем у незараженных клеток; в начале этого периода наблюдается возрастание интенсивности, а в конце — резкий спад до уровня фона; затем следует «темновой» период: 1,5—3 ч интенсивность имеет минимальное значение, близкое к уровню фона; затем интенсивность вновь возрастает, как правило, превышая первоначальное значение в 2—3 раза; и в течение следующих 2—6 ч регистрируется электромагнитное излучение значительной интенсивности.

Нетрудно заметить, что временной ход кривой излучения системы вирус — клетка в общих чертах, повторяющихся во всех опытах, достаточно точно отражает этапы взаимодействия вируса с клеткой: период адсорбции и проникновения (40—60 мин); латентный период (1,5—3 ч) и репродукцию вирусной частицы.

Особый интерес представляет соответствие различий в этих временных интервалах для различных вирусов: у РІІК-содержащеги вируса соответственно все периоды в 1,5—2 раза короче, чем у ДІІК-содержащих аденовирусов, и кривая излучения культуры КЭ, зараженной вирусом, аналогично «сжата» в 1,5—2 раза по сравнению с кривыми излучения культуры ФЭЧ, зараженной Ad-23, и культуры Z-клеток, зараженной Ad-5, с другой стороны, минимальное время проявления «зеркального» эффекта для опытов с вирусом FPV — 4 ч, а для аденовирусов —6ч можно объяснить тем, что интенсивность излучения за соответствующее время заведомо достигает максимального значения.

Причем интегральная интенсивность излучения («светосум- ма») системы вирус — клетка в несколько раз выше интегральной интенсивности излучения незаряженных клеток или клеток, зараженных нечувствительным к ним вирусом (рис. 6).

Очевидно, это удовлетворительно объясняет, почему под действием излучения инфицированных клеток в наших моделях при использовании биологических детекторов появляется «зеркальный» ЦІІЭ, а не наоборот,— излучение «здоровых» клеток угнетает развитие вируса.

Описанная форма усредненных кривых интенсивности электромагнитного излучения системы вирус — клетка, по-видимому, отражает закономерности взаимодействия вируса с чувствительной клеткой. Корреляция длительности различных фаз излучения с типом вируса позволяет судить о специфике электромагнитного излучения клеток, находящихся в экстремальном состоянии — это становится очевидным при сравнении кривых излучения каждого опыта. При более длительной регистрации излучения клеток, зараженных аденовирусом 5-го типа, и ФЭЧ, зараженных Ad- 23>, получено повторение описанных циклов излучения (рис. 7).

Таким образом, полученные пами данные позволяют надеяться, что модуляционные характеристики электромагнитного излуче-

Рис. 7. Изменение интенсивности излучения культуры /.-клеток, зараженных аденовирусом (иеосреднен- ная кривая).

е

§ 70- %%50- II50 $ 10

I | г |—I I I I I -I > I I I' г I

5 10 15Время, ч ния клеток, пораженных вирусом (или другим экстремальным агентом), несут информацию об инфекционном процессе, управляя и обусловливая развитие мнимого вирусного поражения — «зеркального» ЦГ1Э. Можно предположить, что модуляция сигнала имеет частотныіі характер, т. е. с изменением состояния клеточного метаболизма меняется спектральный состав излучения клетки. Предположение о 'возможности спектральной модуляции тем более вероятно, что биологическое действие облучения с различным спектральным составом имеет существенные отличия. Например, свет с длиной волны 280 нм и интенсивностью 10⁵ /іѵ/см-с ускорял наступление первой волны почкованием в дрожжевой культуре, синхронизированной голоданием [Конев, 1965], а облучение сфокусированным лучом гелий-кадмие- вого лазера монослоя культуры клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека приводит к повышению уровня хромосомных перестроек [Мостовников, Хохлов, 1977J.

С другой стороны, еще Бауэром (1934) обсуждалась возможность «поляризованного лучеиспускания» и вероятность «значения поляризованного света для некоторых биологических процессов». Из этих соображений вытекает принципиальная сложность регистрации излучения живых объектов [Бауэр, 1934] с помощью фотоэлектрического эффекта, так как результат измерения будет зависеть от взаимного расположения поверхности детектора и направления поляризованного света (.максимальная интенсивность будет регистрироваться, если плоскость электрического вектора электромагнитного излучения будет перпендикулярна поверхности детектора).

Рассматривая излучение биологической системы в качестве возможного регулятора биологических функций, Ф. Попп (1979), анализируя результаты своих измерений сверхслабого испускания фотонов живых клеток, считает, что биологические системы можно представить как связанные нелинейные осцилляторы; каждый осциллятор можно рассмотреть как полный резонатор, а поскольку речь идет о резонансе, то предполагается высокая поляризация и проводимость при крайне эффективной трансформации и утилизации энергии и способности системы хранить информацию в течение продолжительного времени.

Кроме того, хотя современная теория информации и связи отвергает возможность модуляции сигнала по интенсивности вследствие крайней ненадежности этого способа, по-видимому_г

81

5. В П. Казначеев, П. П. Михайлова

неправомерно не принимать и его во внимание при исследовании чрезвычайно чувствительных и тонких биологических механизмов.