Глава III

ДИСТАНТНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В СИСТЕМЕ ДВУХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ПРИ ПОРАЖЕНИИ ОДНОЙ ИЗ НИХ ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ АГЕНТОМ БИОЛОГИЧЕСКОЙ, ХИМИЧЕСКОЙ ИЛИ ФИЗИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

Изучение дистантных межклеточных взаимодействий проводилось на системе двух тканевых культур, размещенных в изолированных камерах таким образом, что между клетками сохранялся лишь оптический контакт через стеклянные, кварцевые или слюдяные подложки. Одна из тканевых культур подвергалась воздействию экстремального агента. Вторая служила детектором цитопатических изменений, возникших в пораженных клетках.

В качестве экстремальных § агентов использовались: вирус Коксаки А-13, вирус классической чумы птиц (FPV), двухлористая ртуть (сулема), ультрафиолетовая радиация.

Культура ткапи, служившая объектом исследований, выращивалась в специальных камерах на припаянных к шлифу кварцевых, слюдяных или стеклянпых подложках различной толщины (от 0,2 до 1,0 мм). Пропускная способность кварцевых и слюдяных пластинок в области 220—360 нм составляет 70—90%, для стекол в видимой области начиная с 380—400 пм. Применялись нервичные культуры фибробластов человеческого и куриного эмбриона, перевиваемая ткань почек обезьяны и др.

После того, как па дне камер образовался монослой, камеры с внесеппым повреждающим агентом монтировались попарно с иптактными доньями-подложками и закреплялись на вращающемся барабане перпендикулярно оси. Барабан находился внутри затемненного термостата (t = 37°С) и вращался вместе с камерами со скоростью 25 об/ч. Таким образом, клетки в обеих камерах равномерно омывались питательной средой, не подсыхали и не голодали. Контроль на выявление спонтанной дегенерации клеток культуры ткапи постоянно сопровождал все опыты. Спонтанная дегенерация не наблюдалась.

Через 2—4 сут камеры извлекали, демонтировали, стекла подложки с выросшими па них клетками отпаивали и после фиксации и окрашивания препараты подвергали морфологическому исследованию.

Учет цитопатического эффекта велся по отношению числа погибших клеток к числу всех клеток и по типу морфологических изменений. Слабоположительный ЦПЭ оценивался отношением

1. : 10, средний — 1:5, выраженный — 1:2. Всего поставлено около 12 000 экспериментов.

Исследования, проводимые в области электромагнитного излучения биосистем, уже сейчас показывают, что, испускаемое всеми живыми клетками, оно представляет собой источник ценной информации о состоянии клеточных структур.

Однако в литературе почти отсутствуют данные о роли био- хемилюминесцентного излучения при вирусной инфекции. Вместе с тем процесс взаимодействия вируса с клеткой и, как следствие этого, репродукция вируса сопровождаются глубокими изменениями клеточного метаболизма, что не может не отразиться па характере химических реакций, ответственных за излучение.

При взаимодействии вирусов с клетками культуры тканей наблюдаются различные изменения, которые обусловливаются рядом факторов* среди них большое значение имеют степень чувствительности клеток культуры к вирусу п условия среды. Встреча вирусов с л осп р и им чип ими клетками к культуре тканей сопровождается либо латентной инфекцией клеток, либо острой. Ирн острой форме инфекции наблюдаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к гибели. Явления, вызывающие нарушения структуры клетки иод воздействием вируса, называют цитоиатическим действием (эффектом) вируса. Однако ЦПД считают конечным этапом взаимодействия вируса с клеткой [Жданов, 1964]. На ранних этапах этого взаимодействия, а нри латентной инфекции — и на более поздних репродукция вируса в зараженных клетках не сопровождается их гибелью. Клетки остаются жизнеспособными и внешне могут не отличаться от контрольных. При более детальном изучении процесса взаимодействия вирусов с клетками культуры тканей установлено, что он является сложным и многоступенчатым.

Па ранних этапах как при остром, так и латентно протекающем инфекционном процессе воздействие вируса на клетки приводит к изменению некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Как показывают многие исследователи ІЛиджапарндзе, Боголюбова, 1962; Ждано» и др., 1902; Л гол, 1966; Тнхопепко, 196(3; л др.], вирусы, инфицируя восприимчивую клетку, вызывают нарушения в процессах биосинтеза. Путем биохимических исследовании зараженных клеток обнаружено усиление синтеза нуклеиновой кислоты.

К числу ранних проявлений вирусной инфекции плетки может быть отнесено, очевидно, и увеличение размера их ядер. Первым ото явление описал Парпет в 1956 г. Увеличение размера ядра, но его представлению, есть результат необычной физиологической активности клетки вследствие проникновения в нее нуклеиновой кислоты вируса. Этот феномен систематически изучался Р. 13. Хе- синым с сотрудниками [Хесии и др., 1959а, б] и назван авторами дезилтегратнвнылг набуханием. Оно исследовалось в однослойных культурах клеток, зараженных вирусами полиомиелита, осповак- цины и др. По мнению Р. І>. Хесшна, в основе дезинтегративного набухания ядер клеток лежит усиление некоторых сторон клеточного метаболизма, наблюдающееся в течение латентного периода взаимодействия вируса и клетки. Эта реакция не зависит от дозы вируса, ие связана с величиной вирусных частиц, не является результатом избирательного поражения ядра или цитоплазмы и не зависит от типа клеточной культуры. Все вышесказанное свидетельствует о том, что дезиптегративное набухание ядер является неспецкфической реакцией клеток иа присутствие вируса в среде и характеризует наиболее ранний период патогенного действия вируса.

Когда начальный этап взаимодействия вируса и клетки, во время которого происходит перестройка ее обмена веществ, заканчивается, наступает второй этап — специфическая реакция клетки на воздействие данного вируса. Она очепь многообразна.

3 В II. Качпачроп, Д. II Мпхлплора

Одним из ее проявлений является собственно цитопатичесш эффект (ЦПЭ) — повреждение клеток под воздействием вирус Локализация и динамика наблюдаемых при этом патологическі изменений чрезвычайно разнообразны, и в этом заключается осн ва специфичности ЦПЭ. Так, аденовирусы поражают ядра ші ток, вирус гриппа вызывает изменения главным образом в циі плазме, вирусы полиомиелита и энцефалитов примерно в один ковой степени разрушают ядро и цитоплазму. На втором эта взаимодействия вируса и клетки одновременно с морфолоі ческими изменениями, а иногда и раньше происходят измеі ния обмена веществ [Жданов, 1964, 1966, А гол, 19661.

Характер морфологии ЦПЭ определяется свойствами виру и клетки. Так, при воздействии вируса полиомиелита на клет почек обезьяны резкие изменения и гибель клеток наблюдают уже через 12—18 ч [Ворошилова, 1979]. При воздействии виру гриппа іга эти клетки дегенеративные изменения долгое вре отсутствуют, и к цитоплазме появляются включения, в котор концентрируется почти вся РІІК клетки [Горбунова, 190U}.

Решающее значение па скорость наступления ЦПЭ оказывав с одной стороны, доза вируса. Большая доза обычно вызыві раннее проявление цитонатического действия. Примером моі служить цитопатические действия микровирусов. Средние и мал дозы вируса позже вызывают ЦІІЭ, и процесс гибели клетки yflj няется, что позволяет выявить характерные включения в клеткі изменения их обмена веществ. Включения бывают цитоплазі тические (вирус полиомиелита л др.) к внутриядерные (адепо русы), представляющие собой кристаллы вируса. В других слу ях внутриклеточные включения представляют собой ітродл реакции на вирусную инфекцию. Такими включениями моі быть тельца А при герпессе, дающие отрицательную реакц на ДНК.

ЦПЭ зависит и от клетки, ее возраста, физиологического стояния. Характер реакции у культур тканей на один и тот же вирус может быть различным: одни культуры обнаруживают і раженную дегенерацию, сопровождающуюся размножением руса; у других культур не отмечается морфологических изме ний, хотя вирус размножается; некоторые культуры совершеі не чувствительны к воздействию вируса.

Интересно отметить, что при выработке клетками невосп имчивости к данному вирусу средние размеры ядер не отличаю от размера ядер клеток контрольных восприимчивых культ К числу ранних ответных реакций зараженных культур относя также и реакции, выражающиеся в гибели части клеток, вызв ной токсическими действиями аденовируса. Было отмечено j витие дегенеративных изменений в культуре эмбриональной т ни человека через 18 ч после введения 10⁶—10⁷ тканевых цитош генных доз (ЦПЭ₅₀) вируса гриппа типа Д [Тарасов, 1958]. ' скольку развитие этих изменений сопровождалось быстрым ш

нием инфекционного титра вируса при отсутствии нарастания титра гемагглютининов в культуральной жидкости, они были отнесены за счет токсического действия вируса.

Таким образом, ясно, что в клетке, инфицируемой вирусом,, происходят одновременно процессы синтеза сложного вещества для построения вирусной частицы и процесса распада клеточных структур с высвобождением продуктов этого распада. Морфологические критерии этих явлений зависят от типа вируса и вида клетки-хозяина, но остаются при этом достаточно специфичными. Четким тестом характера взаимодействия вирулентного вируса с клеткой можно считать ІЦІЭ.

<• Приведенные материалы свидетельствуют о том, что развитие вируса в клетке сопровождается глубокими сдвигами метаболизма «о всех его выражениях.

ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО АГЕНТА ВИРУСА КОКСАКИ А-і;{

Вирус Коксакн А-13 принадлежит к семейству пикорновиру- сов. Это небольшие (~40 мм) РНК-содержаіцие вирусы икосаэд- рической формы, без оболочек.

Вирусы Коксаки Л-13 размножаются в первичных культурах клеток тканей и органов эмбриона человека и приматов, в культурах почечной и амниотической тканей человека.

Цитопатическое действие вируса Коксакн А-13 выражается в дегенерации клеточных культур, завершающейся полной деструкцией клеток с последующим их отслоением и освобождением из них вирусных частиц. На окрашенных препаратах ЦПЭ характеризуется пикнозом ядер, исчезновением ядрышек, появлением в центре клеток РНК-содержащих эозинофильных масс, которые, увеличиваясь в размерах, смещают ядро к периферии клетки.

Биологической особенностью вирусов Коксаки А-13 является способность вызывать у новорожденных мышей вялые параличи, обусловленные распространенным миозитом с острым воспалением и некрозом (типа ценкеровского) скелетных мышц.

Типировапие вирусов Коксаки А-13 проводят в реакциях нейтрализации, задержки гемаглютинации или реакции связывания комплемента.

Для заражения вирусом Коксаки А-13 брали первичную культуру ткапей эмбриона человека (ФЭЧ). Кожно-мышечные кусочки человеческого зародыша трипсинизировали на магнитной мешалке 2—3 раза по 7—10 мин в 0,25%-ном растворе трипсина. Полученную взвесь клеток центрифугировали при 1500 об/мин, добавляли питательную среду 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота (из расчета 300 000 клеток на 1 мл среды) и разливали по 5 мл в камеры. Однослойную культуру клеток эмбриона человека ны- ращивали в термостате при 37°С в течение 3—4 сут.

В подготовленные камеры с выросшей культурой ткани вносили по 0,3 мл вируса (ТОД 30—10~⁵) на 5 мл питательной среды. Зараженные камеры монтировали попарно (как указывалось выше) с незаражеігными, помещали в термостат и выдержи пали там до появления четкого цитоиатического действия вируса (т. е. до 4—5 сут).

В качестве контроля состояния клеточной культуры ткани использовали смонтированные камеры с культурой той же серии посадки. Через 4—5 сут камеры извлекали, демоитировали, стекла-подложки отпаивали и изготавливали препараты для .морфологических исследований. Предварительно из каждой камеры (зараженной и незараженной) забирали культуральную жидкость для пассажа на выделение вируса.

С вирусом Коксаки А-13 исследовано 180 пар камер с кварцевыми подложками с внесением в одну из камер вируса и 180 нар контрольных камер с кварцевыми подложками без вируса. Контрольные камеры находились в тех же условиях культивирования, что и зараженные (вертящийся барабан). Из 180 нар камер с кварцевым стеклом, зараженных вирусом, индуцированное действие в «зеркальной» культуре получено в 131 паре камер, отрицательный эффект — в 49 нарах камер. В 180 парах камер, не зараженных вирусом, несиецифической дегенерации не наблюдалось.

Морфологические изменения в клеточных культурах, зараженных вирусом Коксаки А-13

Первые признаки цитоиатического действия вируса Коксаки А-13 появляются через 24—36 ч и заключаются в дискомплекса- ции монослоя и появлении крупных клеток с базофилыюй цитоплазмой. Число делящихся клеток резко уменьшается. В дальнейшем округлившиеся базофильные клетки подвергаются пик- нозу: сморщиваются, становятся полигональными: ядро резко гиперхромно. Затем ншшотизировашіые клетки разрушаются, и наряду с отдельными сохранившимися фибробластами можно наблюдать пикнотические «обломки» дегенерированных клеток. Их соотношение с нормальными меняется в зависимости от выраженности цитоиатического действия. Однако первым этапом дегенерации, как правило, является крупная, округлая базофильная клетка. На поздних стадиях цитоиатического действия этих клеток уже нет, и можно видеть два морфологически полярных элемента: нормальный фибробласт и пикнотические «обломки» цитоплазмы и ядер погибших клеток (фото 5).

Морфология «зеркального» ЦПЭ

В «зеркальных» культурах наблюдалось нарушение митотического цикла и угнетение митозов. Появлялись изменения іі хромосомном аппарате: можно было наблюдать гигантские хромосомы, нарушение процесса удвоения хромосом. Наряду с указанным обнаруживалась также дискомплексация клеточного пласта с появлением пикнотически измененных клеток, содержащих большое количество РНК в протоплазме. Подобные клетки в дальнейшем разрушались. Фактически в «зеркальных» культурах наблюдались те же зволютивные формы дегенерации, что и в зараженных вирусом.

Однако темп развития ЦПД в «зеркальных» камерах по сравнению с зараженными был ниже — «зеркальное» ЦПД появлялось па 12—13 ч поздпее (фото 6).

Результаты исследований

Положительный «зеркальный» ЦПЭ в опытах с применением в качестве окстремального агента вируса Коксаки А-13 отмечался в 74% случаев (табл. 4). На микрофотографиях препаратов из зараженных и «зеркальных» камер, если камеры — индуктор и детектор имели оптический контакт через кварцевые или слюдяные подложки, видны изменения, специфичные для вируса Коксаки А-13 (фото 7—12).

Контрольная группа состояла из 100 пар камер с простым стеклом в качестве подложки и внесением в одну из них вируса. Пи в одной контрольной паре камер положительного цитопати- ческого эффекта в «зеркальной» культуре не было получено (фото 13, 14), т. е. при наличии специфических изменений в камере-ин- дукторе, зараженной вирусом Коксаки А-13 (см. фото 1 Л, при оптическом контакте через простое стекло в камере-детекторе — нормальная культура (см. фото 14).

В 90 парах камер с простым стеклом и 180 нарах с кварцевым незаражениых вирусом неспецнфической дегенерации не было (см. табл. 4).

При пассаже культуральной жидкости, взятой из камер, в которых клетки культуры были заражены Коксаки А-13, регулярно выделялся вирус, идентифицированный серологически при реак-

Т а б л и ц а 4

1}(>с11|и>11звсдспис ЦПЭ в «зеркальной» клеточной культуре при дистантном воздействии культурой, зараженной вирусом Коксаки А-13

	Число исследованных		пар камер
Камер;!		С «зеркаль	Без зеркаль
		ным» ЦПЭ	ного ЦПЭ
Простое стекло -- вирус	100	(1	100
Простое стекло без вируса	90	0	90
Кварцевое стекло -|- вирус	180	131	49
Кварцевое стекло бік) вируса	180	0	180

дни нейтрализации как Коксаки А-13. Из культуральной жидкости «зеркальных» камер, в которых клеточная культура не была заражена вирусом, пра 3-кратных последовательных пассажах вирус не выделили.

Для воспроизведения ЦПЭ в «зеркальной» культуре необходимо соблюдение следующих условий.

1. В качестве подложки для клеток применяли кварцевые пластины не толще 0,8 мм.

2. Камеры, соединенные понарно, должны вращаться со скоростью 25 об/ч. В камерах другой конструкции, где предусматривалась возможность исключить вращение при сохранении остальных условий (оптический контакт, свободный доступ питательной среды), «зеркальный» ЦПЭ не развивался.

3. На период контактирования смонтированных пар зараженных и «зеркальных» камер должна быть обеспечена темнота. На свету «зеркальный» цитонатический эффект не проявлялся.

4. Время контакта не менее 6 ч.

Таким образом, при соблюдении определенных условий и прежде всего при наличии оптического контакта через среду с высокой пропускной способностью в УФ-диапазоне электромагнитного спектра цитопатические изменения культуры ткани, вызванные вирусом Коксаки А-13, могут обусловить цитопатические проявления аналогичного характера в интактной культуре.

ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО АГЕНТА ВИРУСА FPV

Название «мпксовирусы» предложено С, ТТ. Андревесом для группы вирусов, поражающих человека и животных и характеризующихся сродством к мукопротеипам (муко — слизь клеточных оболочек) и ферментативной активностью в отношении этих веществ. Под этим названием объединены вирусы гриппа типов А,

В, С; вирусы истинной чумы кур; ложной чумы кур (болезнь Ныо- касЛа) и эпидемического паротита [Жданов и Букринская, 19691.

Вирус классической чумы птиц принадлежит к типовому виду ортомиксовирусов (Orthomyxovirus) и морфологически сходен с вирусом гриппа А. Собственно вирус классической чумы птиц (FPV) представляет собой одну из разновидностей вируса гриппа птиц А (Mixovirus influenca А — virus Focol plagur — 27).

Это РНК-содержащий вирус средних размеров (90—120 им), сферической формы, имеющий оболочку. ІІуклеокапсид построен по спиральному типу симметрии. FPV имеет 2 антигена V—F и антиген-гемагглютинин.

Вирус хорошо размножается в аллонтойсной полости 10— 11-дневных куриных эмбрионов, вызывая гибель эмбрионов через 18—28 ч. Индикатором размножения вируса служит реакция ге- магглютшіации. Для пассирования вируса FPV л а культуре тк ани используют следующие клеточные культуры: первичные — фибробласты куриных эмбрионов, почки эмбрионов крупного рогатого скота — и перевиваемые культуры — СПЭВ, ВПК, СЭЛ, Hep-1, Hela, А-1 и т. д.

Цитопатический эффект под действием вируса развивается обычно медленно и характеризуется появлением групп округлых зернистых клеток, количество которых увеличивается по мере удлинения сроков инкубирования. Постепенно клетки сморщиваются и отслаиваются от стекла.

Вирус классической чумы птиц избран как обладающий ге- магглютинирующими свойствами, по которым его можно обнаружить так же, как и по цитопатическим проявлениям в культуре фибробластов куриного эмбриона.

Для культивирования вируса классической чумы птиц FPV использовали клетки фибробластов эмбриона кур 8—11-дневного возраста. Яйца мыли в проточной воде с мылом, затем скорлупу несколько раз обрабатывали спиртом, обжигали тупой конец яйца и обеззараживали йодом. Скорлупу над воздушным пространством срезали ножницами. Извлекали зародыш, удаляли глаза, клюв, лапки и крылья, а тело промывали раствором Хенкса. Суспензию клеток готовили путем механического измельчения зародыша с последующей трипсинизацией ткани. Готовили взвесь клеток фибробластов из расчета 300 ООО клеток на 1 мл среды и заливали по 5 мл в камеры. В качестве питательной среды использовали среду 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Однослойную культуру клеток фибробластов выращивали в термостате при 37°С в камерах в течение 48 ч. Вирус (предварительно оттитрованный) вносили в культуру клеток в количестве 1.00 ЦТД.

Использовался штамм вируса классической чумы птиц, полу пенный из Института вирусологии АМН СССР им. Д. И. Ивановского. Инфекционную активность вируса поддерживали пассажами на куриных эмбрионах. Для заражения культуры ткани в камерах использовали 0,3 мл взвеси вируса с агглютинациои- ным титром 1 : 320 на 5 мл питательной среды.

Эксперимент с вирусом классической чумы птиц проводили но той же схеме, что и с вирусом Коксаки А-13. Поскольку цито- натнческое действие вируса классической чумы птиц проявлялось в полной мере к концу 2-х сут после заражения, время контактирования зараженной и «зеркальной» камеры ограничивали

2. сут.

По истечении 2 сут камеры демонтировали, культуральную л; ид кость н зараженных п «зеркальных» камерах исследовали на наличие гемагглютининов и пассировали на куриных эмбрионах іга предмет выявления вируса. Дно камер отпаивали, и растущая на нелі культура подвергалась морфологическому исследованию.

Морфологические изменения в культуре куриных фибробластов, зараженных вирусом классической чумы птиц

Морфологические исследования показали, что во всех зараженных камерах наблюдалось цитопатическое действие, характерное для вируса классической чумы птиц. Оно выражалось в дискомплексации монослоя, округлении большого числа клеток, которые склонны стягиваться в гроздевидные образования. Наряду с этим образуются крупные симпластические структуры, в периферической зоне которых ядра выстраиваются в виде частокола. В последующем отдельные клетки сморщиваются, цитоплазма их окрашивается слабо, а ядра пикнотизируются; такие клетки отслаиваются и окончательный цитоз завершается уже в культуральной жидкости. Ядра симііластов также подвергаются пик- нозу, а сами образования теряют способность реагировать с основными и кислыми красителями (фото 15, а, б).

Морфология «зеркального» ЦПЭ

В лезараженных «зеркальных» камерах, бывших в оптическом контакте с зараженными, is 74—78% случаев наблюдалось наличие «зеркального» цитонатического действия. На первых этапах развития цитонатического действия в «зеркальной» культуре появляется большое число отдельных базофилыіых клеток, многие из которых в дальнейшем окончательно не теряют связи друг с другом, вследствие чего монослой подразделяется на ряд гроздевидных клеточных комплексов. Цитоплазма клеток в этих комплексах значительно вакуолизирована, а ядра уплотнены. В дальнейшем комплексы распадаются на отдельные клетки, которые перестают воспринимать кислые красители и отслаиваются от стекла. Специфические симпластические структуры в «зеркальных» культурах не образуются (фото-16, а, б). Таким образом, сходство ряда элементов «зеркального» Ц11Э с истинным очевидно.

Результаты исследованиіі

С вирусом классической чумы птиц исследовано 118 пар камер с кварцевыми подложками с внесением в одну из камер вируса и 115 пар камер с кварцевыми подложками без внесения вируса (контроль).

В итоге получены следующие результаты: из 118 пар камер с кварцевой подложкой с внесением вируса в одну из камер положительный «зеркальный» цитопатический эффект был получен в 92 парах камер (фото 17, а, б, 18, а, б).

В незаражениых 115 парах камер с кварцевым стеклом неспецифической дегенерации не наблюдалось (табл. 5).

Т а б л и ц а 5

Вослроизведенпе ЦПЭ в «зерка.іышіі» клеточной культуре при дистантном воздействии культурой, зараженной вирусом классической чумы птиц

Парные камеры с подложкой	Число исследованных пар камер
	Всего	С «зеркальным» ЦПЭ	Без «зеркального» ЦПЭ
Простое стекло -|- вирус ......	120		120
Простое стекло без вируса	100	—	100
Кварцевое стекло + вирус	118	92	2G
Кварцевое стекло без вируса ....	115	—	И5

Пассирование культуралыюй жидкости из зараженных и незараженпых камер показало, что вирус присутствует только в зараженных камерах. В «зеркальных» камерах при пассаже вирус не обнаруживался. При постановке гемагглютинации с петушиными эритроцитами и культуральной жидкостью из зараженных камер гемагглютинация отмечена в титрах 1 : 40, 1 : 80, 1 : 1(50. Культуральная жидкость из зеркальных камер даже при наличии «зеркального» цитопатического действия положительной реакции не давала, что свидетельствует об отсутствии вируса. Обнаружено. что для развития «зеркального» цитопатического действия требуется не менее 4 ч контакта между зараженной и незаряженной камерами. Остальные условия получения «зеркального» ЦПД аналогичны описанному в разделе о вирусах Коксаки А-13. Выраженность дегенеративных изменений в «зеркальных» камерах варьировала и зависела от времени контакта с зараженной культурой.

При проведении контрольных опытов с зараженном вирусом FPV — 120 пар камер с простым стеклом и 100 пар камер с простым стеклом, не зараженных вирусом, находившихся в тех же условиях культивирования, что и первые, в камерах, зараженных вирусом, проявлялось его цитонатическое действие, в «зеркальных» же камерах культура хорошо росла, никаких дегенеративных изменений не наблюдалось (фото 19, 20). В 100 парах незараженпых камер, культивируемых в тех же условиях, ткань была без цитопатических изменений. Из полученных результатов видно, что при использовании в качестве экстремального для клеток культуры ткани агента в виде вируса классической чумы птиц «зеркальное» цитопатическое действие, напоминающее по морфологии вирусное, наблюдалось в 78 % случаев. Отсутствие вируса в культуралыюй жидкости из «зеркальной» камеры при трех последовательных пассажах убедительно указывает на то, что полученный ЦПЭ не связан со случайным внесением в «зеркальные» камеры инфекционного начала.

ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО АГЕНТА АДЕНОВИРУСА

Аденовирусы — это вирусы средних размеров (70—90 нм), не содержащие оболочек. В состав вирусных частиц входит дезоксирибонуклеиновая кислота; размножение вируса происходит в ядрах инфицировапных клеток. Частицы вируса имеют форму икосаэдра с 252 капсомерами.

Аденовирусы, насчитывающие по меньшей мере 31 антигенный тип, составляют отдельную группу микроорганизмов, вызывающих у человека инфекцию преимущественно дыхательных путей и глаз. Вирусы, входящие в группу, обладают общим группоспецифическим антигеном, обнаруживаемым реакцией связывания комплемента, и типоспецифическими антигенами, которые выявляются в реакциях нейтрализации и торможения гемагглютина- ции. К важным свойствам аденовирусов относятся устойчивость к эфиру, относительная устойчивость в широких границах pH и способность к размножению, сопровождающаяся цитопатиче- скими изменениями в различных культурах, клеток человека и обезьян.

При наблюдении нативных неокрашенных клеточных культур, зараженных аденовирусами, по данным некоторых авторов, удастся выделить три разновидности цитопатических изменений: 1) ЦПЭ общего типа (характеризующийся равномерным распределением округленных клеток с повышенным коэффициентом лучепреломления; 2) ЦПЭ периферического типа (первые изменения появляются на периферии зараженного клеточного пласта, пораженные клетки собираются в группы, напоминающие гроздья тшограда); 3) ЦПЭ «гнездного» типа. Па фиксированных окрашенных препаратах цитонатическое действие аденовирусов человека на чувствительные культуры впервые наблюдается примерно через 1(5—18 ч после инокуляции. Вначале в ядрах появляются мелкие округлые оксифилыіые включения размером около I мкм, окруженные светлой зоной («гало»). В некоторых случаях включения однородны, в других — имеют форму колец с прозрачной сердцевиной, очень слабо красятся эозином. В дальнейшем число таких ранних включений быстро нарастает. Иногда они тесно прилегают друг к другу. Часто встречаются слоистые многоконтурные включения. Описываемые изменения наблюдаются в течение первых суток инфекции. За это время резко увеличиваются размеры ядер пораженных клеток. Наблюдаются нарушения агре- ѵатпого состояния хроматина, его огрубение, формирование сетчатых структур; появление хроматина в виде глыбок и зерен.

Па поздних сроках инфекции наблюдаются глыбки эозинофильного или базофильного материала в цитоплазме клеток, пораженных аденовирусом. Процесс завершается сморщиванием п отторжением клеток [Дрейзин, 1966].

*

В этой ссрші экспериментов использовался аденовирус 5-го типа, хорошо размножающийся в клетках перевиваемой культуры почек обезьяны (МК) с ярким цитопатическим действием.

Культуру ткани МК снимали раствором версена со стекла матрасов, на которых ее культивировали; цетрифугировали, а осадок разводили питательной средой 199 плюс 10% сыворотки крупного рогатого скота (из расчета 100—120 тыс. клеток на 1 мл среды) и разливали в камеры по 5 мл в каждую. В камеру с выросшей культурой ткани вносили по 0,5 мл взвеси аденовируса

5. го типа (ТПД_5о) на 5 мл питательной среды. Затем зараженные камеры соединяли с интактными и помещали в термостат с вращающимся барабаном на 2—3 сут. В течение этого периода времени цитопатическое действие вируса проявлялось в полной мере. В дальнейшем камеры демонтировали, культуральную жидкость забирали для пассажа на выделение вируса, культуру клеток, выросшую па дне-подложке, подвергали морфологическому исследованию.

Морфология ЦПД аденовируса 5-го типа

В зараженных вирусом камерах с культурой клеток МК наблюдали все характерные признаки цитопатического действии аденовируса. Они выражались в разбухании и округлении клеток, которые собирались затем в агрегаты типа тутовой ягоды. В некоторых клетках образовывались внутриклеточные ядерные и цитоплазматические включения. В дальнейшем клетки подвергались пикнозу, лизису и отслаивались от стекла (фото 21).

Морфология «зеркального» ЦПД

В незаражениых камерах, находящихся и контакте с зараженными и течение 2—3 сут, в 72% случаев наблюдался «зеркальный» ЦПЭ. Он выражался в дезинтеграции монослоя, в тенденции к агрегации в Ниде тутовой ягоды отдельных элементов, в некотором набухании и последующем значительном сморщивании клеток. На завершающем этапе происходила почти тотальная гибель клеток, подвергавшихся в конечном итоге лизису (фото 22).

Результаты экспериментов

С аденовирусом 5-го типа исследовано 170 нар камер с кварцевыми стеклами с внесением в одну из камер вируса (опыт) и 140 пар камер с кварцевыми стеклами без внесения вируса (контроль). Из 170 опытных пар камер в 122 парах наблюдалось индуцированное «зеркальное» ЦПД (фото 23—26). В 140 контрольных парах камер неспецифической дегенерации не наблюдали (табл. 6).

В контрольных опытах с аденовирусом взято 150 пар камер с простым стеклом в качестве подложки. Во всех камерах, зара-

Таблица 6

Воспроизведение ЦПЭ в «зеркальной» клеточной культуре при дистантном воздействии культурой, зараженной аденовирусом 5-го типа

Парные камеры с подложкой	Число исследованных		пар камор
	всего	с «зеркальным» ЦПЭ	без «зеркального» ЦГК)
Простое стекло 4- вирус . . .	150		150
Простое стекло без вируса . .	140	—	140
Кварцевое стекло j- вирус .	170	122	148
Кварцевое стекло без вируса .	140		140

;кеипых вирусом, цитопатическое действие аденовируса 5-го типа соответствовало вышеописанному, а в «зеркальных» камерах ЦПД не наблюдалось, ткань оставалась нормальной (фото 27, 28). В контрольных 140 камерах с простым стеклом и с иезаражен- ной тканыо неспецифической дегенерации не наблюдали.

При последовательных пассажах культуральной жидкости, взятой из камер с «зеркальным» ЦГТД, вирус не выделялся.

Для развития «зеркального» цитопатического действия при применении в качестве экстремального агента аденовируса необходимы те же условия, что и при использовании вируса Коксаки А-13 и вируса классической чумы птиц: использование для подложек кварцевых пластинок толщиной 0,2—0,8 .мм; вращение камер; темнота в период контактирования камер; контакт интакт- ной камеры с зараженной не менее 6 ч.

Таким образом, применение третьего экстремального агента — аденовируса, дало возможность вновь продемонстрировать наличие дистантных взаимодействий в 72% всех опытов.

ПРИМЕНЕНИИ В КАЧЕСТВЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО АГЕНТА ДВУХЛОРИСТОЙ РТУТИ (СУЛЕМЫ)

И качестве еще одной модели цитоиатического состоянии избрано токсическое поражение клеток культуры ткапи куриных и человеческих фибробластов двухлористой ртутыо (сулемой). Механизм действия сулемы связан с блокированием сульфгид- рильных групп, входящих в состав ферментных систем клетки, а также с нарушением биохимической функции тиамина и некоторых аминокислот.

Применялась не коагулирующая, а токсически доза двухлористой ртути, которая вследствие блокады дыхательных ферментов приводила к гибели клеток культуры ткани через 2—3 сут (доза определена авторами).

Доза раствора сулемы оттитрована на культуре человеческих эмбриональных клеток и клеток куриного эмбриона. Была выбра

на такая доза сулемы, которая вызывала сулемовый Ц11Э на 3-и сут после добавления к питательной среде. Доза сулемы равнялась 4—5-у на 1 мл питательной среды.

Как обычно камеры с внесенной сулемой попарно соединялись с иптактными «зеркальными камерами» и в дальнейшем содержались в описанных ранее условиях.

Через 2—3 сут в камерах с сулемой развивался цнтопатиче- ский эффект, выражающийся в дезинтеграции монослоя, зернистой и вакуольной дистрофии клеток и кариопикнозе. Процесс завершался тотальной гибелью мопослоя (фото 29).

В «зеркальных» камерах наблюдался «зеркальный» ЦПЭ, заключавшийся также в дезинтеграции монослоя, вакуолизации и зернистой дистрофии цитоплазмы, кариопикнозе. По степени выраженности процесса гибели клеток «зеркальный» ЦПД несколько отставал от истинного, вызванного сулемой (фото 30).

В серии опытов с сулемой исследованы 120 пар камер с кварцевыми подложками с внесенной сулемой (опыт) и 110 пар камер с кварцевыми подложками без сулемы (контроль) (табл. 7). Из 120 пар опытных камер в 94 случаях получен «зеркальный» ЦПЭ (фото 31—34). В 110 нарах камер с кварцевым стеклом неспецп- фической дегенерации клеточного монослоя не наблюдалось.

В контрольный группе, состоящей из 92 пар камер с простыми стеклами с внесением сулемы, цитопатический эффект в «зеркальных» камерах не наблюдали (фото 35, 36) и в 90 парах камер с простым стеклом без добавления сулемы спонтанная неспецифическая клеточная дегенерация не наступала.

Получение «зеркального» ЦПЭ в опытах с сулемой еще раз подтвердило необходимость соблюдения тех же условий проведения эксперимента, что и при использовании вирусов. Наименьшее время контакта, необходимое для проявления «зеркального» ЦПЭ, равнялось также 6 ч.

Итак, применение в качестве экстремального агента токсического начала — сулемы, оказалось вполне эффективным (78% положительных результатов) для получения «зеркального» эффекта, свидетельствующего о наличии дистантной межклеточной связи.

Таблица7

Воспроизведение ЦПЭ в «зеркальной» клеточной культуре при дистантном воздействии культурой, пораженной двухлористой ртутью

Парные камеры с подложкой	Число исследованных пар камер
	всего	с «лор калъным» ЦІІЭ	без «зеркального» ЦПЭ
Простое стекло + сулема	92	_	92
Простое стекло без сулемы	90		90
Кварцевое стекло + сулема	• 120	1)4	26
Кварцевое стекло без сулемы	110	—	110

ПОЛУЧЕНИЕ «ЗЕРКАЛЬНОГО» ЦПЭ ПРИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ ПЕРЕПАССАЖАХ

Проведена серия экспериментов на возможность перепассажа «зеркального» ЦІІЭ. К «зеркальному» кварцевому стеклу-подлож- ке, находившемуся в 4—6-часовом контакте с зараженной вирусом Коксаки А-13, FPV, аденовирусом 5-го типа или пораженной сулемой камерой (индуктором), вновь монтировалось новое кварцевое стекло-подложка с выросшей клеточной культурой, не пораженной никаким экстремальным агентом (новая «зеркальная» камера); исследования проводили до трех пассажей.

Обнаружено, что от пассажа к пассажу «зеркальный» эффект передается, постепенно угасая к третьему пассажу.

ДИСТАНТНЫЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФИЗИЧЕСКОГО ЭКСТРЕМАЛЬНОГО АГЕНТА — УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ радиации

Дистантные межклеточные взаимодействия обнаружены нами при действии на клетку экстремальных агентов биологической и химической природы; естественно возникает вопрос о проявлении феномена взаимодействий при использовании экстремального агента физического характера, нанример УФ-радиации.

ГІо мнению большинства исследователей, в основе биологического действия УФ-излучения лежат фотохимические превращения биомолекул — белков, нуклеиновых кислот и структурных липидов, участвующих в образовании биомембран; эти превращения могут привести к поражению наследственного аппарата или мембранных образований. Ингибирование деления, мутации и гибель клеток в результате облучения в большинстве случаев относят за счет тех или иных повреждений ядра клетки. Описаны нарушения в структуре ДНК в результате прямого (образования димеров) или опосредованного действия УФ-излучения [Копылов, Королькова, 1973; Самойлова, 1975]. Вместе с тем зти явления могут быть сопряжены и с повреждениями иных клеточных структур [Арман и др., 1971]. Основные эффекты воздействия УФ на клеточные мембранные структуры — увеличение их проницаемости для неорганических ионов и подавление активности отдельных мембранных ферментов и ферментативных комплексов [Рощупкин, 1973; Владимиров, Рощупкин, 1975]. Наиболее важным следует считать ослабление функции пассивного барьера для неорганических ионов, которое наблюдается при небольших дозах облучения, когда фотоинактивация ферментов еще не наблюдается. Нарушение барьерной функции мембран, даже в незначительной степени, может привести к гибели клетки. Кроме эффекта отдаленной гибели клеток УФ-излучение в зависимости от дозы и спектра, а также от физиологического состояния клетки Может привести к стимуляции или торможению деления, а такяіе к повышению жизнеспособности культур, находящихся в угнетенном состоянии. Механизм действия и особенно последействия У_чФ-радиации на биологические системы пока не имеет общепринятого объяснения, однако описана специфичность воздействия УФ-облучения на различных уровнях организации живой природы.

Мы проводили исследования действия УФ-излучеиия па клетки различных культур ткани по двум направлениям. С одной стороны, УФ-радиация рассматривалась как экстремальный агент, вызывающий гибель клеток, со специфичной морфологической картиной и инициирующий «зеркальный» ЦПЭ в гомологичной культуре-детекторе. С другой стороны, выяснялась роль в проявлении «зеркального» эффекта малых доз УФ-радиации, которой облучали культуры-детекторы, имеющие оптический контакт с камерой-индуктором, в которой клетки поражены вирусом. Подбирались дозы облучения, пе вызывающие видимых морфологических изменений в клетках культуры-детектора, а УФ-излуче- ние предположительно можно было рассматривать как превентивное торможение клеточной системы [Плеханов, 1950] при действии стимула подпороговой интенсивности.

В первой серии опытов одну из культур облучали летальной дозой УФ, вторая служила детектором («зеркальная» культура). Источником УФ-радиации была лампа БУВ-30, уделенная на 50 см от камер с клеточной культурой. Дозу облучения подбирали экспериментально так, чтобы получить полную гибель клеточного монослоя через 2—3 сут с характерной для УФ-радиации морфологической картиной (45—50 с). Исследования проводили как на первично трипсинизированных клеточных линиях (ФЭЧ, КЭ), так и на различных перевиваемых клеточных культурах. Камеры с культурой клеток, выращенной на кварцевой подложке и облученной летальной дозой УФ-радиации, стыковали с необлу- ченными камерами с клеточной культурой и помещали в термостат на вращающийся барабан. Через 2 сут камеры извлекали, демонтировали, подложки с выращенными клетками отпаивали, после фиксации и окрашивания культуры подвергали морфологическому исследованию. Препараты фиксировали метиловым спиртом или 10%-ным формалином и окрашивали по Романовскому, Браше гематоксилин-эозином.

Морфологические изменения в клеточной культуре, пораженной УФ-радиацией, соответствовали описанным в литературе: первоначально клетки теряют свои тинкториальные свойства и, прежде всего, перестают окрашиваться основными красителями. В дальнейшем ядерное вещество конденсируется в плотное гипер- хромное тело. Цитоплазма остается оксифильной. Затем ядерное вещество распыляется, а клетки превращаются в округлые плазматические образования, подвергающиеся глыбчатому распаду. В случае выраженного ЦПЭ весь монослой представляет собой

Т а б л и ц а 8

Воспроизведение ЦПУ ^в «зеркальной» клеточной культуре при контакте с облученной ультрафиолетом камерой

Іііід опыта	Тип подложек и стыкованной паре камер /детектора \іпідуктор j	Время УФ-об- лученші, с	Камера Л ЦПЭ УФ	Камера В («зеркальный» ЦНЭ)	Число ОПЫТОВ
Контроль ткани	Кварцевое Кварцевое	ІІе облуч.	0	0	100
» »	Стекло Стекло	»	0	0	100
» подложки Oiii.it	Кварцевое УФ	45	100	0	100
	Стекло Кварцевое — УФ	(камера А) 45 (камера Л)	500	389	500
	Кварцевое

Примечание. Камера А — детектор, камера В — шідуктор.

поле, усеянное глыбчатыми бесструктурными оксифилыіыми массами (фото 37). В «зеркальных» культурах характер морфологических изменений менее выражен, но по существу идентичен (фото 38). В облученных и «зеркальных» препаратах (фото 39, 40), как правило, гибель клеток начинается с центра, а по периферии в течение некоторого времени сохраняется кольцевая зона нормальной ткани, что, по-видимому, связано с процессами рассеивания и поглощения света на грани раздела двух оптических сред: кварцевое стекло — камера. Все эксперименты сопровождали контролями на выявление спонтанной дегенерации в необлучепной культуре. Камеры с выросшей культурой клеток монтируются попарно и помещаются в термостат вместе с опытными, через 48 ч камеры демонтируются, а клетки на стеклах-подложках окрашиваются азур-П-эозином, и препарат просматривается на наличие неспецифической спонтанной дегенерации. В контроле условий опытов вместо кварцевой подложки использовали простое стекло. Методика эксперимента та же. При использовании простых стекол «зеркальный» ЦПЭ не развивался, в то время как в облученной камере появлялась морфологическая картина, характерная для УФ-излучения (фото 41, 42).

Воспроизведение ЦПЭ в «зеркальной» культуре при контакте с облученной клеточной культурой наблюдалось в 389 случаях из 500 (табл. 8).

В результате этой работы показано, что при действии УФ-ра- диации возникает «зеркальный» ЦПЭ. Число камер с положительным «зеркальным» ЦПЭ составляет 78%. Наличие эффекта не может быть артефактором, так как передача «инфекционного» начала из одной камеры в другую исключается физической природой экстремального агента. Эта работа еще раз подтверждает наличие дистантных межклеточных взаимоотношений, обусловленных наличием оптического контакта, который характеризуется тем, что используемые оптические среды хорошо пропускают ультрафиолет. Условия получения «зеркального» эффекта аналогичны''описанным выше — вращение, проведение эксперимента в темноте₄ достаточное время контакта (не менее 4—6 ч).

Процесс гибели клеток при действии на пих повреждающих агентов описан Д. II. Насоновым и В. Я. Александровым (1940). Впачале изменения носят неспецифический характер. Впоследствии на фоне неспецифических изменений проявляются характерные морфологические особенности, специфические для вызывающего их раздражителя. Мы неоднократно подчеркивали, что для проявления специфических черт ЦПЭ необходим некоторый промежуток времени. Сигналы от погибавших клеток культуры- индуктора воспринимаются культурой-детектором, в которой развиваются неспецифические изменения, а снустя некоторое время, в зависимости от состояния гомеостазиса клетки и его взаимодействия с экзогенными факторами, клетки «зеркальной» культуры гибнут с характерными признаками специфики данного воздействия.

Цейтраферная киносъемка в течение 72 ч развития «зеркального» ЦПЭ при поражении клеточного мопослоя УФ-радиацией полностью подтвердила сходство морфологической картины поражения и гибели клеточного индуктора и детектора при УФ- облучении с некоторым (12 ч) запаздыванием развития цитопатичѳ- ского эффекта в «зеркальной» культуре-детекторе.

Во второй серии экспериментов выяснялась роль малых доз УФ-радиации, воздействующей па культуру-детектор при воспроизведении «зеркального» ЦПЭ с помощью вирусного поражения клеток культуры-ипдуктора. «Зеркальная» культура подвергалась предварительному УФ-облучению малой дозой перед стыкованием с зараженной вирусом камерой. Доза подбиралась экспериментально к каждой серии опытов (10—15 с облучения лампой БУВ-30 на расстоянии 0,5 м). Использовался аденовирус 5-го типа. Опыт проводился по обычной методике. Через 48—72 ч камеры демонтировались, а клетки на стеклах-подложках окрашивались азур-ІІ-эозипом. Результаты опытов представлены в табл. 9.

Как видно из представленного материала, облучение мопослоя в «зеркальпой» камере малой дозой УФ способствует проявлению «зеркального» ЦПЭ в 100%. Клеточная культура в контрольных зкспериментах в условиях такого же облучения остается непораженной.

О стимулирующем действии малых доз радиации на различные биологические объекты существует довольно много указаний [Cork, 1957; Carlson е. а., 1957; Тимофеев-Ресовский, Лучник, 1957; Кузин, Юсипов, 1967]. По литературным данным известно, 5то если воздействовать раздражителем на клеточную популяцию

Воспроизведение ЦПЭ в «аеркальноіі» культуре при предварительном облучении ее малыми дозами УФ-радиаціш

Вид опыта	Тип подложек (детеитор\ ^индуктор J	Время облучения, с	Экстре мальный агент	Камора А (ЦІІЭ вир)	Камера В (<‘Г>ер- чаль- ный» ШІЭ)	Число опы тов
Контроль ткапи	Кварцевое Кварцевое Стекло Стекло	Не облучался »	Нѳ вносился »	0 0	0 0	100 100
Контроль правиль	Кварцевое	15 (камера В) 15 (камера В) (камера В)	»	0	0	100
ности выбора доз УФ Облучение камеры В	Кварцевое Стекло Стекло Кварцевое		» Ad-Ъ (камера А)	0 159	0 158	100 159
	Кварцевое

Примечание. Камера А — индуктор, камера В — детектор.

тотчас же после облучения, то наблюдается усиление действия последнего [Календо, 1972].

Известно, что клетки в процессе перехода из одного состояния в другое наиболее уязвимы. Чуствитольность их к повреждению в это время может быть очень высокой. Например, известно, что на протяжении митотического цикла клетки неоднократно вступают в критические периоды (переходы профаза — метафаза, метафаза — анафаза и др.) [Епифанова, 1965]. При этих фазовых переходах радиочувствительность клеток может возрастать в 20 раз [Кузин, Юсипов, 1967].

В экспериментах с предварительным УФ-облучением культуры-детектора УФ-радиация не вызывает гибели клеточной популяции, но является фактором, нарушающим устойчивую неравно- весность клетки, происходят изменения па уровне молекулярных комплексов, вызывающие репаративные процессы; это качественно новый уровень, на котором живые клетки могли бы адаптироваться, но они получают от зараженных вирусом клеток новый сигнал, вызывающий изменения, приводящие к гибели. В результате многократной дестабилизации репаративные процессы в клетках становятся несостоятельными, что проявляется в увеличении количества случаев с положительным «зеркальным» ЦПЭ (до 99,9%).

ДИСТАНТНЫЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МОДЕЛИ УПРАВЛЯЕМОГО МИТОТИЧЕСКОГО ЦИКЛА

Одним из подходов к изучению электромагнитного капала связи, который, как мы предполагаем, лежит в ультрафиолетовой области спектра и играет определенную роль в развитии цитопатиче-

ского эффекта, является создание конструктивной модели, позволяющей исследовать биологическую роль электромагнитного излучения в жизненном цикле клетки, в отличие от ранее использованной модели экстремального воздействия на клеточную систему. В этой модели информация касается изменения жизненного цикла клеток монослоя путем введения митостатического вещества в нормально развивающуюся культуру ткани и передачи этого воздействия «зеркальной» культуре клеток.

На протяжении жизненного цикла клетка может переходить к процессу пролиферации из состояния покоя и из состояния выполнения специфической функции [Епифанова и др., 1967; Алов и др., 1969; Аспиз, 1974]. Это заставляет предположить, что существует сложная система регуляторных механизмов пролиферации, а не наличие единого пускового мехбнизма митоза, типа триггерного. На основании полученных данных появляется возможность вмешательства в процесс размножения клеюк на разных этапах из жизненного цикла [Епифанова, 1973 J. Жизненный цикл клеток, сохранивших способность к митозу, расчленяется на несколько этапов. Митоз представляет собой конечный этап делого ряда процессов, объединенных под названием митотического цикла. Представления о регуляции митотического цикла в настоящее время расширились: не все процессы митотического цикла можно объяснить последовательным функционированием отдельных генов. Предполагается [Епифанова, 1973], что многие важные процессы регулируются уровнем конечных продуктов, т. е. по принципу обратной связи. Ведутся исследования не только собственно митотического цикла, но и процессов, связанных со вступлением клетки в цикл и переходом ее в состояние покоя (гетеро- синтетическая и автосинтетическая интерфаза). Возможность расчленения клеточного цикла с помощью различных ингибиторов (колхицин, колцемид, пуромицин и т. д.) и возможность изучения каждого периода цикла в отдельности позволили нам получить новую модель дистантных межклеточных взаимодействий с помощью колцемида, вызывающего метафазный блок (к-митозы) в камере-индукторе, и передачу этой информации в «зеркальную» Камеру. К-митозы получали, обрабатывая культуру клеток производным колхицина — колцемидом (ІѴ-диацитил-ІѴ-метиоколхи- цин). Изменения показателей митотического режима «зеркальной» культуры изучали при получении колцемидного митоза в опытной камере путем введения в последнюю 0,02 мкг/мл колцемида. Данная концентрация оказалась наиболее подходящей для получения оптимального количества митотических клеток и наименее токсичной при 24-часовой экспозиции.

Действие колцемида на клетку обратимо, причем по сравнению с другими митостатическими агентами этот алкалоид более эффективен и менее токсичен [Stabblefild, 1965]. Колцемид —наиболее часто применяемый ингибитор при выходе из метафазного блока. Этот алкалоид ингибирует полимериаацию блоковых субъединиц, из которых образуются микротрубочки веретена — структуры, обеспечивающие расхождение хромосом и останавливающие митоз на стадии перехода от метафазы к анафазе. После отмывания клеток от колцемида и при использовании его в оптимальных концентрациях не наблюдается изменений в строении митотического аппарата клеток. В литературе имеются данные о морфологических изменениях клеток, обработанных колцемидом [lloltzer, 1975 j, по использованию ингибитора в опытах на различных культурах ткани в зависимости от концентрации и времени действия ингибитора [Lalley, 1974]. Показано, что колцѳмид не препятствует переходу клеток от взвешенного в среде состояния к прочному прикреплению к субстрату [Ivanova, 1976].

Опыты проводили на культуре клеток Нер-2 (перевиваемая линия злокачественной эпителиальной ткаии, полученная из раковой опухоли гортани человека) и НИ (перевиваемая линия доброкачественной эпителиальной ткани, полученная из почки человека). Клетки выращивали но общепринятой методике. Плотность посева составляла 80 тыс./мл. В опытах использовали 24-часовую культуру. Конечная концентрация колцемида равнялась 0.02 мкг/мл. Контролем служила культура, инкубированпая в одинаковых условиях, но без добавления колцемида, лишь со сменой ростовой среды, параллельно с опытпыми культурами. Исследования проводили следующим образом. Г1а монослой, выращенный на кварцевых стеклах в камерах, наносился колцемид —

0. 02 мкг/мл одновременно с заменой ростовой среды на среду 199 без бычьей сыворотки. Дальнейшее культивирование клеток происходило в соответствии с ранее использованной методикой постановки опытов на кварцевых стеклах (получение «зеркального» ЦПЭ). Через сутки камеры снимали, стекла фиксировали метанолом 15 мин и окрашивали гематоксилин-эозином. Результаты обрабатывали по методике, предложенной С. Б. Стефановым (1974а, б).

Морфологическую обработку препаратов проводили с помощью морфометрической сетки. Сетка состоит из топких волокон, натянутых на кольцо, которое вкладывается в окуляр микроскопа, па плоскость его диафрагмы. Она состоит из 16 квадратов одинаковой величины, образующих большой квадрат или полное рабочее поле сетки. Измеряющими элементами сетки являются узлы, образуемые перекрестками нитей сети в пределах рабочего поля. Измеряемые объекты характеризуются тремя величинами: К — количество объектов на площади сетки; Р — число узлов сетки, попавших в объекты данного класса; Т — число пересечений контуров объектов данного класса с линиями сетки. Если фигуры рассеяны строго случайно по препарату или его части, выделенной объективными границами, то эти величины связаны с характеристиками препарата прямой пропорциональностью: К со К (среднему количеству объектов па площади), Р со S (средней площади фигур па площади препарата), Т со / (средней длшіе контуров объектов данного класса на площади препарата).

Эти три величины необходимы и достаточны для сравнения фигур в подавляют,ем большинстве задач экспериментальной и диагностической морфологии.

Увеличение микроскопа и величина сетки выбираются так, чтобы число объектов в поле зрения в среднем не превышало 5—7.

Число К определяется в выбранном рабочем поле. Границы рабочего ноля разделяются на две одинаковые по длине области — разрешенную и запрещенную. Все объекты, расположенные внутри рабочего ноля или пересекающие его разрешенную границу- учитываются и входят в число К; все фигуры, пересекающие запрещенную границу, пе учитываются. Число Sp определяется в том случае, когда требуется выяснить соотношение площадей двух или нескольких объектов. Sp подсчитывается но всем 25 узлам сетки. К задачам измерения Sp относится определение ядерпо-клсточного или ядерно-нлазменного отношения. При этом подсчитывается число узлов, попавших па ядро, па цитоплазму, и после статистической обработки определяется отношение. Число Т находится подобным же образом.

Целью статистической обработки является приведение множества данных к такому виду, который позволяет сравнивать между собой величины на объективной основе. Эта цель достигается в том случае, когда средние величины дополнены величинами их доверительных интервалов.

Доверительный интервал вычисляется наиболее строго в множествах, подчиненных закону нормального распределения. Для полной гарантии нормальности иолучешшх распределений множество разбивается на несколько случайных групп (подвыборок), средине которых распределяются нормально (но центральному правилу Чебышева).

Морфометрические данные записываются в таблицу, каждая строка которой содержит 10 гнезд для записи 10 величин, полученных в процессе измерения. Так формируются подвыборки по 10 величин. Их сумма, деленная на 10, дает среднюю для подвыборок М_Лй. По нескольким десяткам подвыборок получают несколько Л/,„, для которых вычисляют среднюю средних М_п — М₁₀, где п — число десятков. Доверительный интервал вычисляют по формуле Стрелкова L - AR, где L — доверительный интервал; А — амплитуда вариационного ряда, R — коэффициент Стрелкова.

Из результатов опытов (табл. 10) мы получили наглядную картину изменения жизненного цикла культуры клеток в «зеркальной» культуре после 24-часовой экспозиции с клетками, подвергавшимися действию колцемида.

Митотическая активность в «зеркальных» препаратах более чем в 2 раза превышает митотическую активность в контроле, что свидетельствует о передаче не только цитоиатического действия

Влияние культуры клеток, обработанных колцемидом, на клеточный цикл «зеркальной» культуры клеток

Митотическая активность в ыонослое, %			Плотность роста монослон, %
с колцемидом	«зеркальная»	контрольная	с колцемидом	«зеркального»	контрольного
0,2±0,02	1,4+0,07	0,9+0,09	6,3+0,4	14+0,6	13±0,8
0	1,3±0,06	0,9+0,09	0	14+0,4	13+0,8
0	1,2±0,05	0,0+0,05	0	6,2+0,6	7,4+0,5
0,(№±0,007	2,0±0,06	0,9±0,00	2,2+0,3	6,8±0,2	6,4±0,5
0,16±0,01	1,5±0,06	0,7+0,04	4,6+0,4	5,8+0,6	7,2+0,5
0	2,9+0,1	1,8+0,05	0	18+1,2	18,5+1,2

Примечание. Вид ткани: периые три опыта—Нер—2, последующие—ЯН.

(факт, установленный в наших ранее проведенных опытах), но и о возможности дистантно изменять жизненный цикл клетки.

Число ядер на единицу площади в «зеркглышх» препаратах (параметр Sp) практически не отличается от этого параметра контроля, что, вероятно, указывает на одинаковую скорость образования монослоя в сравниваемых культурах клеток и одинаковое поведение культур в исследуемые сроки опыта. Митотическая активность опытных культур намного меньше, чем контроля и «зеркальных» препаратов (см. табл. 10).

Sp опытных препаратов также значительно ниже (в 2 раза) Sp контрольных и «зеркальных» препаратов. Это связано с токсическим действием колцемида, а также с тем, что митотические клетки имеют слабый контакт с подложкой и легко смываются при вращении в барабане (на этом явлении основан один из методов получения синхронной культуры). Так как ЦПЭ в «зеркальной» камере, по нашим данным, запаздывает на 10—12 ч, то митотические клетки еще держатся на стекле и их в 2 раза больше, чем в колцемидной камере.

Всего проведено 180 экспериментов, из них 90 контрольных, в которых обнаружено наличие дистантных межклеточных взаимодействий между изолированными культурами ткани при действии колцемида на клеточную культуру.

При 24-часовом оптическом контакте культуры клеток, обработанных колцемидом, с «зеркальной» культурой в 51 «зеркальной» камере (из 90) обнаружена четкая картина колцемидпого блока, вызванного дистантным воздействием клеток индуктора, в которых развивается истинный процесс ингибирования полимеризации белковых субъедипиц.

Количество ядер на единицу площади (показатель Sp) контроля и «зеркала» имеет равные по величине значения, что свидетель-

ствует о нормальном состоянии монослоя в контрольных и «зеркальных» каморах в отлично от камор, в которые был внесен кол- цемид, вызывающий, по всей видимости, но только изменения митотического цикла, но и метаболические нарушения в клетках.

Подробно передачу изменений митотической активности исследовали минские ученые В. А. Мостовников и И. В. Хохлов (1977). Используя оригинальную методику биодетекции, они обнаружили угнетение и стимуляцию митотической активности в культуре-детекторе под действием электромагнитной волны, преломленной алюминиевым зеркалом, что полностью устраняет все сомнения о природе материального носителя информации при наблюдении дистантных межклеточных взаимодействий. В качестве экстремальных агентов В. А. Мостовников и И. В. Хохлов использовали излучение различных лазеров и химические мутагены (колхицин и диметилсульфат).

В результате спектрального анализа минскими учеными показано, что излучение, вызывающее митотические изменения, расположено в диапазоне 250—500 нм.

ОЦЕНКА ДОСТОВЕРНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

При статистической обработке описанных в предыдущих главах результатов наших исследований мы их рассматривали как противопоставляемые друг другу (альтернативные) состояния: положительный «зеркальный» эффект (+) и отрицательный «зеркальный» эффект (—). Необходимо оценить вероятность появления каждого из альтернативных признаков и значимость различия (или сходства) воздействия различных факторов (различных экстремальных агентов; различных каналов связи — кварцевое или простое стекло; дополнительного кратковременного УФ-облуче- шія культуры-детектора) на появление «зеркального» эффекта.

Альтернативные признаки выражаются в абсолютных значениях частот: т — число опытов с положительным «зеркальным» эффектом; п — т — число опытов с отрицательным «зеркальным» эффектом, где п — общее число опытов; или долях единицы — р = т!п; q = 1 — т/п; или в процентах от общего числа наблюдений. Как все биологические признаки, альтернативы варьируют по величине, и поэтому к ним применены законы вариации и статистические характеристики: арифметическое среднее (р), ошибка

репрезентативности ('т_ѵ = j/~—~ определяющая погрешность оценки; доверительный интервал, в котором с определенной вероятностью находится генеральный параметр: ~р + tm_p, где tm_p = Ар — доверительная граница доли положительных «зеркальных» эффектов, т. ѳ. та максимальная ошибка, с которой оце-

Таблиц а 11

Статистическая обработка результатов проявления «зеркального» ЦПЭ

			Экстрема.		ыіый агент
Статистическая характеристика	LTD О f- G S Щ	с 00 йй И 3	0, ь, о.	Сулема	СС ~ ав CZ О,— Ѳ|	О 6	? - У' Т' >> "5 Ь fc- Сч ” ^ ~ - = “S и 5 и і с и	О	£ Е .іія и-, О
Число опытов: всего	170	180	118	120	500	90	159		1500
с положительным «зеркальным» ЦПЭ	122	131	92	94	389	51	157		0
Среднее арифметическое: в долях единицы	0.72	0.75	0.78	0.78	0.78	0.57	0,99		0
в процентах	72	75	76	78	78	57	99		0
Ошибка репрезентативности, %	3,4	3.2	3,8	3,8	1,9	5,3	0,8		0
Верхняя доверительная граница, % Р= 95	77	81	83	85	81	67	100		0
.Р=99,9	88	85	91	91	84	74	100		0
Нижняя доверительная граница, % і>=95	65	69	71	71	74	47	97		0
Р=99,9	61	(И	65	05	71	40	96		0
Доверителышіі интервал, % Р=95	6.6	6,2	7,'і	7.4	3.7	10,3	1,5		0
.Р=99,9	11.2	10,о	12,5	12,5	6,2	17,4	2,6		0

пивается генеральная доля но данным выборочных наблюдений.

Величина t (нормированное отклонение от среднего значения) определяется по специальным таблицам: так, для доверительной вероятности Р — 95% (5%-ный уровень значимости) t — 1,96, а для Р = 99,9% t =-- 2,39 [Лакнн, 1973J.

Результаты статистической обработки полученных данных представлены в табл. И.

Вторая задача о значимости различия (или сходства) в воздействии различных факторов на конечный результат опытов решается с помощью особых критериев соответствия, называемыми также критериями согласия. Одним из таких критериев, широко используемых в биометрии, является критерий %², предложенный Пирсоном в 1901 г. При использовании критерия у¹ для оценки различных состояний одного и того же качественного признака данные группируются в таблицы различной конструкции (табл. 12). Для четырехполыюй табл. 12 критерий %² можно вычислить по формуле

Распределение непрерывно, поэтому для использования этого критерия для дискретных величин, особенно на малочисленных группах, вводится поправка Иейтса на непрерывность, и формула для вычисления критерия приобретает вид

Результаты вычислений критериев у² для распределений влияния на «зеркальный» эффект различных факторов представлены в табл. 13. Полученные намизначения в несколько раз превышают критическое значение для 0,1%-го уровня значимости

[по Плохинскому, 1970]. Таким образом, можно утверждать, что с вероятностью 99,9% опытные распределения отличаются от всех контрольных. Следовательно, нужно признать закономерность появления «зеркального» эффекта лишь при воздействии любого из рассмотренных экстремальных агентов и наличии оптиче-

Т а б л и ц а 12

Четыремюльная таблица для вычисления критерия у-

«Зоркалышй» эффект

Пара камер	+	-	Сумма
Опытная (экстремаль-.	а	ъ	а '-Ь
иыіі агент, кварцевая подложка) Контроль	с	d	с \ d
С у м м а ....	а ;-С	b-j-d	п ~-а '—Ь \-с \-d

Т а б л и ц а 13

Результаты вычисления критерия %³ при определении отличия опытных и контрольных экспериментов

	Экстремальный агент
Уклонил контроля	Вирус Ad-Ь	Вирус FPV	Вирус Коксаки А-13	Суле ма	УФ-ра- диация (1 мин)	Колце мид
Экстремальный агент, стекло простое Без экстремального агента, кварцевое стекло	53,168 45,046	149,244 144,9	109,15 101,05	126,32 142,49	217,83 213,75	68,39 65,43
Без экстремального агента, стекло простое	45,046	131,71	101,05	124,48	217,83	54,32

Результаты вычисления критерия %² при определении сходства действия различных экстремальных агентов

Экстремальный агент	Экстремальный агент
	Вирус FPV	Вирус Ad-5	Вирус Коксаки Л-ІЗ	Сулема	УФ-ра- диацин	Ко.чце- мид
Вирус FPV		0,399	0,098	0,008	0,007	9,8
Вирус Ad-Ъ	0,399		0,030	0,474	0,59-	10,59
Вирус Коксаки А-13	0,098	0.030		0,142	0,168	10,48
Сулема	0,008	0,474	0,142		0,00002	14,5
УФ-радиация	0,007	0,59	0,168	0,00002		16,9
Колцемпд	9,8	10,59	10,48	14,5	16,9

ского контакта через кварцевые подложки. Кромо того, очевидно (табл. 14), что вероятность появления цитопатического «зеркального» эффекта даже с достоверностью 95% не зависит от природы экстремального агента, вызывающего гибель клеточного монослоя (так как критическое значение у_ѵ² — 3,8, а все полученные значения %² намного меньше). При сравнении же воздействия колцемида (модель управляемого клеточного цикла) с воздействием других экстремальных агентов оказывается, что по критерию %² распределения отличаются друг от друга, особенно для большого числа опытов (воздействие сулемы и УФ-раднащш отличается от воздействия колцемида с достоверностью 99,9%).

Если вернуться к табл. 11, то можно отметить, что средняя вероятность появления «зеркального» эффекта при действии колцемида ниже, чем вероятность появления «зеркального» эффекта для других экстремальных агентов, вызывающих гибель клеток.

Аналогично можно показать, что при облучении монослоя клеток в камере детектора малой дозой УФ-излучения (15 с) вероятность появления «зеркального» эффекта с достоверностью 99,9% отличается от таковой при заряжении ткани индуктора аденовирусом без облучения детектора (х² = 42,23 > 10,8 для уровня значимости 0,01%).

Такіш образом, результаты статистической обработки свидетельствуют о том, что «зеркальный» эффект нельзя считать случайной флуктуацией, причем эффективность действия всех экстремальных агентов относительно воспроизведения «зеркального» цитопатического эффекта достоверно не различается. Эффект воздействия экстремального агента, управляющего митотическим циклом, несколько ниже, и .хотя доверительные интервалы вероятности перекрываются, по критерию у? можно утверждать, что различия существуют. При предварительном же облучении клеток детектора наблюдается достоверное повышение эффективности дистатных межклеточных взаимодействий.

ДИСТАІІТНІЛЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ ДВУХ ГЕТЕРОГЕННЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

В данном раздело работы поставлена задача изучить «специфичность» электромагнитного канала связи в гетерогенных клеточных системах. Нами проведены исследования видовой и тканевой специфичности электромагнитного капала связи. Ранее получены экспериментальные данные, подтверждающие информационную роль собственных электромагнитных излучений клетки в гомологичных тканевых культурах, поэтому закономерно возникает вопрос: насколько специфичны электромагнитные сигналы от клеток различного происхождения, и могут ли клетки одной природы воспринять оптические сигналы, испускаемые клетками другой прпроды.

В качестве критерия работы оптического канала использовано наличие или отсутствие «зеркального» цитопатического эффекта в гомологичных культурах-детекторах при заражении культуры- индуктора тем или иным экстремальным агентом.

Подбор культур тканей, служащих индуктором или детектором, осуществляли исходя из их видового, тканевого и органного происхождения. С этой целыо мы сопоставили клетки разных тканей одного вида животного, а также клетки одной ткани, но разных ііидоа, исследовали эффект дистантных межклеточных взаимодействий (ДМВ) в клетках из одного и того же органа, но у различных животных. Кроме того, важно было определить, осуществляется ли передача «зеркального» ЦПЭ внутри злокачественных линий культуры ткани или между злокачественными и доброкачественными тканями.

В исследованиях использованы методы биологического детектирования. В качестве клеток одного вида были выбраны следующие клеточные культуры: первично трипсипизированпые фибро- бласты эмбриона человека (ФЭЧ) и клетки глаза эмбриона человека (ГЭЧ), перевиваемые линии эпителия амниотической оболочки человека (FI и АМН), перевиваемая линия клеток эмбриона почки человека {RH), перевиваемая культура эпителиальных клеток раковой опухоли шейки матки человека (Неіа), перевиваемые клетки карциномы гортани человека (ІІер-2).

Межвидовые представители культуры ткани: первично тряпси- низированные фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ), перевиваемые линии клеток паховых желез обезьяны (ПАО), мышиные фибробласты (L), почечный эпителий эмбриона свиньи (СПЭВ), почка эмбриона человека (RH). Злокачественные линии культур тканей: перевиваемая культура эпителиальных клеток рака шейки матки человека (Неіа), перевиваемые клетки раковой опухоли гортани человека (Нер-2).

Культуру-индуктор подвергали либо заражению вирусом куриной чумы {FPV), аденовирусами 5-го и 7-го типов, либо облуче- ниго ультрафиолетом или поражали раствором двухлористой ртути. Детектором служила одна из вышеперечисленных иптактных культур ткани, гегерологическая по отношению к зараженной, называемая пами «зеркальной» культурой. Культура-детектор и зараженная культура били полпостью разобщены в специально изолированных камерах с автономной для каждой системы клеток питательпой средой. Между указанными культурами поддерживался только оптический контакт через кварцевые стекла или слюдяные подложки, на которых росли клетки исследуемой культуры ткани. После того как на подложке образовался монослой клеток, в одну из камер вносился указанный агент, другая оставалась нн- тактной. Затем камеры монтировались попарно, зараженная с не- зараженной, и помещались в термостат. Через несколько суток камеры вынимались, демонтировались, стекла-подложки с выросшими на них клетками фиксировали, окрашивали и подвергали морфологическому анализу. Фиксацию проводили метиловым спиртом или 10%-ным формалином, окрашивали по Романовскому и гематоксилин-эозином.

Все исследования сопровождались соответствующими контро- лями па выявление спонтанной дегенерации в незаражепной культуре, на выявление вируса из зараженной и «зеркальной» камер при 3-кратном пассаже культуральной жидкости и получением «зеркального» ЦПЭ при исследовании гомологичных культур.

В серии ош.ітов с гетерогенными клеточными культурами тканей (ФЭЧ и КЭ) рассмотрены две модификации, при которых детектором последовательно являлась каждая из указанных культур. Поражающим агентом был вирус классической чумы птиц (FPV). Исследовано 45 пар камер, где ткань КЭ заражалась FPV, а ткань ФЭЧ служила детектором. Во всех случаях положительный «зеркальный» эффект не наблюдался. При заражении ФЭЧ 40 пар камер, где детектором была КЭ, положительный «зеркальный» эффект также отсутствовал. При проведении этой серии экспериментов в качестве контроля служили гомологичные парные ткани КЭ—КЭ и ФЭЧ—ФЭЧ, одна из которых в указанных парах была заражена тем же вирусом (табл. 15). Отмечается преобладание положительного «зеркального» эффекта в парах КЭ—КЭ: 31 пара из 45. В системе ФЭЧ—ФЭЧ положительный эффект не получен, поскольку, как известно, эта культура ткани не поража- ется данным вирусом. Второй серией контроля были работы, направленные на установление наличия спонтанной дегенерации в культурах ФЭЧ—КЭ, соединенных попарно. На 27 парах камер показано отсутствие спонтанной дегенерации.

Последующие эксперименты послужили продолжением вышеописанного, по отличались от него расширением круга гетерогенных тканей и использованием аденовируса 5-го типа в качестве экстремального агента, исследовались Нер-2, ПАО; Нер-2-ІІеЬа\ Нер-2—СПЭВ; Неіа — ГІАО и др. Методика постановки эксперимента та же, а результаты представлены на табл. 16—30. Как

показано в таблицах, «зеркальный» Ц11Э для гомологичных тканей наблюдается, как правило, в большинстве пар камер (80— 70%), в то время как для гетерогенных он либо отсутствовал, либо колебался (в случае ІІер-2 ■— Hela от 23 до 30%, в почечных линиях RII — СІІЭВ от 12 до 14%, в камерах, где взяты почечная ткань и злокачественпая, от 6 до 14%).

В следующей серии экспериментов определялась возможность возникновения «зеркального» ЦПЭ в системах гетерогенных культур клеток: АМН, RH, ГЭЧ и Нер-2. Поражающим агентом служил раствор сулемы в концентрации 5 мкг/мл или ультрафиолетовое облучение. В каждом эксперименте рассмотрены две модификации, при которых каждая из культур последовательно использовалась сначала в качестве детектора, затем в качестве индукто-

ра. Контролем служили гомологичные пары ГЭЧ—ГЭЧ, АМН— АМН, RH—RH, Нер-2—Нер-2, в которых одна из культур была поражена сулемой или У Ф-об лучением.

Отмечается высокий процент положительного «зеркального» ЦПЭ в парах АМН—АМН (60) и ГЭЧ—ГЭЧ (70). Ни в одной из гетерогепных пар АМН—ГЭЧ положительный «зеркальный» ЦПЭ но наблюдался. Как и ранее, обнаружено наличие дистант-

ных взаимодеиствии между эпителиальной почечной линиеи RH и злокачествеппой культурой клеток Лер-2 (18%).

Различные тканевые культуры классифицированы и оценены силой связи друг с другом относительно возможности реализации межклеточных дистантных взаимодействий (табл. 31).

Реализация дистантных межклеточных взаимодействий в клеточных гетерогенных системах (сводная таблица проявления «зеркального» ЦПЭ), %

Культу ра- индуктор	Культура-детектор
	ФЭЧ	кэ	Нер-2	Hela ПАО		СПЭВ	L	Fl	RH	AMU	ГЭЧ	мк
ФЭЧ	73	0	0	0	0	0	0					0
кэ	0	73
Нер-2			70	30	0	0	0	0	14			20
ІІеІа	0	0	23	70	■ 0				6
ПАО			0		63			0
СПЭВ			4			81			14			33
L	0		0				68
FI			0	0	0			70
RH	0		16	6		12			75	0	0
АМН									0	70	0
ГЭЧ									0	0	60
мк 1 0 j			40			зз 1 j J 1						76

Ряд клеток этой матрицы не заполпен, так как эксперименты продолжаются. ІІо мере заполнения матрицы удастся описать более полно биологические специфические характеристики дистантного канала межклеточных взаимодействий.

Анализируя полученные данные, считаем, что клетки гомологичных тканей способны к воспроизведению с высоким процентом положительного «зеркального» ЦГ1Э (62—83), а в гетерогенных клеточных культурах мы получили самые различные результаты. В перевиваемых злокачественных липиях Нер-2, Hela в 23—30% мы получили «зеркальный» ЦПЭ, наличие канала связи, видимо, можно отнести за счет того, что обе ткани злокачественной природы от одного вида (человека). Там же обнаружено наличие связи между двумя эпителиальными почечными линиями (от 12 до 14%) и между неревиваемыми линиями почки и злокачественными линиями (6—12%).

В серии исследований на клетках различных культур ткани показано, что ранее описанное дистантное электромагпитное межклеточное взаимодействие биологически специфично и реализуется

65

5. В. П. Казначеев, Л. П. Михайлова

только в генетически близкородствепиых линиях клеток. По мере нарастания гетерогенности липий эффект взаимодействия исчезает.

* *

•

Таким образом, на основании изложенных экспериментальных данных мы можем высказать предположение о природе описанной формы межклеточной связи. Нами показано, что тканевые культуры, разобщенные двойным слоем кварцевых или слюдяных подложек, ведут себя как единая система: если одпа из культур поражается, иапример, вирусной инфекцией или УФ-радиацией, то вторая, казалось бы совершенно здоровая и независимая, через некоторое время воспроизводит изменения, которые наблюдаются в первой культуре.

Изменения в незараженной «зеркальной» культуре-детекторе специфичны: клетки детектора в значительной мере копируют весь цикл превращений, происходящих в клетках культуры-индуктора. Однако такие морфологические признаки, как вирусные включения, в «зеркальной» культуре никогда не обнаруживались. Именно поэтому мы говорим о «чертах сходства и различиях» культуры индуктора и детектора.

Дистантные межк-леточные взаимодействия характеризуются строгой специфичностью сигнала и ответа на пего, это подтверждается спецификой картин «зеркального» эффекта по отношению к соответствующему экстремальному агенту и тем, что «зеркальный» эффект реализуется в гомологичных клеточпых линиях, используемых в качестве индуктора и детектора, и отсутствует в гетерогенных культурах, генетически отдаленных друг от друга.