38. Гниение белков в толстом кишечнике. Механизмы обезвреживания образующихся продуктов в печени.

Г ниение– процесс расщепления азотсодержащих веществ, в результате жизнедеятельности микроорганизмов. В основе гниения лежат реакции декарбоксилирования и дезаминирования аминокислот. Аминокислоты, невсосавшиеся в клетки кишечника, используются микрофлорой толстой кишки в качестве питательных веществ. Ферменты бактерий расщепляют аминокислоты и превращают их в амины, фенолы, индол, скатол, сероводород и другие ядовитые для организма соединения. После всасывания эти продукты через воротную вену попадают в печень, где подвергаются обезвреживанию путем химического связывания с серной или глюкуроновой кислотой с образованием нетоксичных кислот (например, фенолсерная кислота). Последние выделяются с мочой. В печени содержатся специфические ферменты – арилсульфотрансфераза и УДФ-глюкоронилтрансфераза, катализирующие соответственно перенос остатка серной кислоты из ее связанной формы - 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС) и остатка глюкуроновой кислоты также из ее связанной формы – уридил-дифосфоглюкуроновой кислоты (УДФГК) на любой из указанных продуктов.

Обезвреживание продуктов гниения аминокислот происходит в клетках печени после поступления веществ из кишечника с кровью воротной вены. Продукты обезвреживания хорошо растворяются в воде и поэтому легко выводятся из организма. Процесс обезвреживания включает, как правило, две фазы (стадии): фазу модификации и фазу конъюгации.

В фазе модификации вещества вступают в реакции микросомального окисления, в результате которого образуются полярные группы —ОН или —СООН. Если такие группы уже имеются, то обезвреживание может происходить непосредственно путём конъюгации.

Реакции конъюгации заключаются в том, что к указанным группам присоединяется определённое соединение (глюкуроновая кислота, серная кислота, глицин и некоторые другие). Активной формой глюкуроновой кислоты является уридиндифосфоглюкуроновая кислота (УДФГК), активной формой серной кислоты - 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС). Формулы этих соединений приводятся на рисунке 10.2.

1) Обезвреживание фенола (реакция глюкуронидной конъюгации):

2) обезвреживание индола: а) гидроксилирование индола (фаза модификации):

б) сульфатирование индоксила (фаза конъюгации):

в) образование калиевой соли индоксилсульфата в канальцах почек:

По количеству индикана в моче можно сделать заключение о скорость процессов гниения белков в кишечнике (при усилении гниения количество индикана увеличивается) и о функциональном состоянии печени (при нарушении обезвреживающей функции количество индикана уменьшается).

3) Обезвреживание бензойной кислоты:

По скорости образования и выведения гиппуровой кислоты с мочой после введения бензойной кислоты можно судить о функциональном состоянии печени. Этот диагностический тест получил название пробы Квика и используется в клинической практике.

39. Тканевой распад белков, маркеры «стареющих» белковых молекул. Ферменты, принимающие участие в деградации белков.

Расщеплению подвергаются в первую очередь белки "состаривших¬ся" или поврежденных клеток, протеины с измененной конформацией, частично или полностью денатурированные молекулы. Клетки разных органов содержат большое количество протеолитических ферментов, которые обеспечивают белковый катаболизм. Основная масса белков распадается в лизосомах под действием лизосомальных пептидгидролаз (катепсинов). Первой стадией обновления белков является их гидролиз с помощью тканевых протеиназ, или катепсинов. Катепсины сосредоточены преимуществен¬но в лизосомах. Белок, подвергающийся гидролизу, взаимодействует сначала с аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом клетки с образование аутофагосом. Аутофагосомы атакуются первичными лизосомами, что приводит к образованию вторичных лизосом). Набор лизосомальных катепсинов быстро гидролизует белки, поглощенные этими ор¬ганоидами. Протеиназы сока цитоплазмы дополняют действие катепсинов лизосом. Все катепсины делятся на экзопептидазы, гидролизирующие крайние пептидные связи с N- или С-конца полипептидной цепи, и эндопептидазы, гидролизующие внутренние пептидные связи. В зависимости от особенностей каталитических групп активного центра различают тиоловые катепсины (в каталитическом центре содержится цистен), аспарагиновые, или карбоксикатепсины (в каталитическом центре—аспарагиновая кислота), и сериновые (каталитический участок представлен серином). Тиоловые протеиназы тканей: Катепсин В – эндопептидаза. Во многих тканях; Катепсин N (или коллагенолитический фермент) - эндопепти¬даза.В лизосомах селезенки и плаценты.Катепсин Н — эндопептидаза и аминопептидаза. В печени. Катепсин L — эндопептидаза. Во всех тканях. Катепсин С(дипептидилдипептидаза I) - экзопептидаза. Катепсин S — эндопептидаза.В селезенки и лимфоузлах. Аспарагиновые протеиназы тканей: Катепсин D — эндопептидаза, активен в селезенке, почках, легких. Сериновые протеиназы тканей: Катепсин А(карбоксипептидаза А) — экзопептидаза.

40. Трансаминирование аминокислот. Структура кофермента и механизм переаминирования. Специфичность трансаминаз. Значение реакций трансаминирования. Диагностическое значение определения в сыворотке крови органоспецифичных аминотрансфераз АЛТ и АСТ. Коэффициент де Ритиса.

В ходе деградации белков накапливается аминный азот, который в отличие от углерода не пригоден для получения энергии за счет окисления. Поэтому те аминогруппы, которые не могут быть повторно использованы для биосинтеза, превращаются в мочевину и выводятся из организма.

Трансаминирование и дезаминирование Из реакции переноса NH2 наиболее важны реакции трансаминирования (1). Они катализируются трансаминазами и участвуют в катаболических и анаболических процессах с участием аминокислот. При трансаминировании аминогруппа аминокислоты (аминокислота 1) переносится на 2-кетокислоту (кетокислота 2). Из аминокислоты при этом образуется 2-кетокислота (а), а из первоначальной кетокислоты — аминокислота (b). Переносимая NH2-группа временно присоединяется к связанному с ферментомпиридоксальфосфату (PLP, см. с. 110), который вследствие этого переходит в пиридоксаминофосфат (схема Б). Если NH2-группа освобождается в виде аммиака, то говорят о дезаминировании (2). Эта реакция протекает по различным механизмам. Отщепление NH3 от амидной группы называют гидролитическим дезаминированием (схема В, фермент [3]). Иногда отщепление NH3 (см. с. 20) сопровождается образованием двойной связи (элиминирующее дезаминирование, не показано). Особенно важноокислительное дезаминирование (2). В такой реакции аминогруппа вначале окисляется до иминогруппы (2а), при этом восстановительные эквиваленты переносятся на НАД+ или НАДФ+. На второй стадии происходит гидролитическое отщепление иминогруппы. В качестве конечного продукта, как и при трансаминировании, образуется 2-кетокислота (схема В).

Механизм трансаминирования В отсутствие субстратов альдегидная группа пиридоксальфосфата ковалентно связана с остатком лизина трансаминазы (1). Этот тип соединения, найденный также в родопсинах (см. с. 346), относится к альдиминам или шиффовым основаниям, во время реакции аминокислота 1 (схема А, 1 а) вытесняет остаток лизина и образуется новый альдимин (2). Затем за счет изомеризации происходит перемещение двойной связи. Полученный кетимин (3) гидролизуется до 2-кетокислоты и пиридоксаминфосфата (4). На второй части реакции (схема А, 1б) те же стадии протекают в противоположном направлении: пиридоксаминфосфат и вторая 2-кетокислота образуют кетимин, который иэомеризуется в альдимин. Наконец, отщепляется вторая аминокислота и регенерируется кофермент. 

Биологическое значение трансаминирования Реакции трансаминирования играют большую роль в обмене аминокислот. Поскольку этот процесс обратим, ферменты аминотрансферазы функционируют как в процессах катаболизма, так и биосинтеза аминокислот. Трансаминирование - заключительный этап синтеза заменимых аминокислот из соответствующих α-кетокислот, если они в данный момент необходимы клеткам. В результате происходит перераспределение аминного азота в тканях организма. Трансаминирование - первая стадия дезаминирования большинства аминокислот, т.е. начальный этап их катаболизма. Образующиеся при этом кетокислоты окисляются в ЦТК или используются для синтеза глюкозы и кетоновых тел. При трансаминировании общее количество аминокислот в клетке не меняется.

Специфичность трансаминаз обеспечивается белковым компонентом. Ферментытрансаминирования катализируют перенос NH₂-группы не на α-кетокислоту, а сначала на кофермент пиридоксаль-фосфат. Образовавшееся промежуточное соединение (шиффово основание) подвергается внутримолекулярным превращениям (лабилизация α-водо-родного атома, перераспределение энергии связи), приводящим к освобождению α-кетокислоты и пиридоксаминфосфата; последний на второй стадии реакции реагирует с любой другой α-кетокислотой, что через те же стадии образования промежуточных соединений (идущих в обратном направлении) приводит к синтезу новой аминокислоты и освобождению пиридоксальфосфата. Опуская промежуточные стадии образования шиффовых оснований, обе стадии реакции трансаминирования можно представить в виде общей схемы:

Диагностическое значение определения в сыворотке крови органоспецифичных аминотрансфераз АЛТ и АСТ Нормальная активность АЛТ в крови мужчин равна 10-40 Ед/л, у женщин – 12-32 Ед/л.Различные уровни повышения активности АЛТ выявляются при острых гепатитах, циррозе печени, обтурационной желтухе и при приеме гепатотоксических препаратов (яды, некоторые антибиотики). Резкое повышение активности АЛТ в 5-10 и более раз является несомненным признаком острого заболевания печени. Причем такое повышение выявляется еще до того как проявятся клинические симптомы (желтуха, боли и прочее). Увеличение активности АЛТ можно засечь за1-4 недели до проявления клиники и начать соответствующее лечение, не дав развиться заболеванию в полной мере. Высокая активность фермента при таком остром заболевании печени после проявления клинических симптомов держится недолго. Если нормализация активности ферментане происходит в течение двух недель, это говорит о развитии массивного повреждения печени.

Коэффициент де Ритиса— соотношение активности сывороточных АСТ (аспартатаминотрансфераза) и АЛТ (аланинаминотрансфераза). Значение коэффициента в норме составляет 1,33±0,42 или 0,91-1,75^[1][2]. Расчёт Коэффициента де Ритиса целесообразен только при выходе АСТ и/или АЛТ за пределы референтных значений. Диагностическое значение] В клинической практике широко используется определение активности ACT и АЛТ в сыворотке крови для диагностики некоторых заболеваний. Определение активности в крови данных ферментов имеет диагностическое значение по той причине, что данные ферменты обладают органоспецифичностью, а именно: АЛТ преобладает в печени, а АСТ — в миокарде, следовательно, при инфаркте миокарда или гепатите обнаружится повышенная активность в крови какого-либо данного фермента. Так, при инфаркте миокарда, активность АСТ в крови возрастает в 8-10 раз^[1], тогда как АЛТ только — в 1,5-2 раза^[1]. При гепатитах активность АЛТ в сыворотке крови возрастает в 2-20 раз^[1], а АСТ — в 2-4 раза^[1]. Норма для АСТ до 40 МЕ или до 666 нмоль/с*л, для АЛТ до 30 МЕ или до 666 нмоль/с*л Коэффициент де Ритиса в пределах нормальных значений (0,91-1,75)^[1] обычно характерен для здоровых людей. Однако, повышение АСТ при одновременном росте отношения АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса больше 2) свидетельствует о поражении сердца, и можно с уверенностью говорить об инфаркте миокарда или ином процессе, связанным с разрушением кардиомиоцитов^[3][4]. Коэффициенте де Ритиса меньше 1 говорит о поражении печени. Высокие уровни ферментемии при всех видах вирусного гепатита за исключением дельта-гепатита характеризуются низким коэффициентом де Ритиса и прогностически являются неблагоприятным признаком течения болезни^[4].

41. Прямое и непрямое окислительное дезаминирование аминокислот. Последовательность реакций, ферменты, биологическая роль.

Дезаминирование аминокислот - реакция отщепления α-аминогруппы от аминокислоты, в результате чего образуется соответствующая α-кетокислота (безазотистый остаток) и выделяется молекула аммиака.

Аммиак токсичен для ЦНС, поэтому в организме человека и млекопитающих он превращается в нетоксичное хорошо растворимое соединение - мочевину. В виде мочевины, а также в виде солей аммония аммиак выводится из организма. Безазотистый остаток используется для образования аминокислот в реакциях трансаминирования, в процессах глюконеогенеза, кето-генеза, в анаплеротических реакциях для восполнения убыли метаболитов ОПК, в реакциях окисления до СО2 и Н2О

П рямое окислительное дезаминирование: Наиболее активно в тканях происходит дезаминирование глутаминовой кислоты. Реакцию катализирует фермент глутаматдегидрогеназа, коферментом глутаматдегидрогеназы является NAD+.

Глутаматдегидрогеназа очень активна в митохондриях клеток практически всех органов, кроме мышц. Глутаматдегидрогеназа играет важную роль, так как является регуляторным ферментом аминокислотного обмена. Аллостерические ингибиторы глутаматдегидрогеназы (АТФ, ГТФ, NADH) вызывают диссоциацию фермента и потерю глутаматдегидрогеназной активности. Высокие концентрации АДф активируют фермент. Таким образом, низкий энергетический уровень в клетках стимулирует разрушение аминокислот и образованиеα-кетоглутарата, поступающего в ЦТК как энергетический субстрат. Глутаматдегидрогеназа может индуцироваться стероидными гормонами (кортизолом).

В печени и почках обнаружен фермент оксидаза L-аминокислот, способный дезаминировать некоторые L-аминокислоты. Коферментом в данной реакции выступает FMN. Однако вклад оксидазы L-аминокислот в дезаминирование, очевидно, незначителен, так как оптимум её действия лежит в щелочной среде (рН 10,0). В клетках, где рН среды близок к нейтральному, активность фермента очень низка. Оксидаза D-аминокислот также обнаружена в почках и печени. Это FAD-зависимый фермент. Оптимум рН этой оксидазы лежит в нейтральной среде, поэтому фермент более активен, чем оксидаза L-аминокислот

Непрямое дезаминирование (трансдезаминирование):Большинство аминокислот не способно дезаминироваться в одну стадию, подобно Глу. Аминогруппы таких аминокислот в результате трансаминирования переносятся на α-кетоглутарат с образованием глутаминовой кислоты, которая затем подвергается прямому окислительному дезаминированию.

Непрямое дезаминирование аминокислот происходит при участии 2 ферментов: аминотрансферазы (кофермент ПФ) и глутаматдегидрогеназы (кофермент NAD+).

Значение этих реакций в обмене аминокислот очень велико, так как непрямое дезаминирование - основной способ дезаминирования большинства аминокислот. Обе стадии непрямого дезаминирования обратимы , что обеспечивает как катаболизм аминокислот, так и возможность образования практически любой аминокислоты из соответствующей α-кетокислоты.

42. Источники аммиака в клетках. Механизм токсического действия аммиака. Пути обезвреживания аммиака. Биосинтез мочевины. Этапы орнитинового цикла, энергетический баланс процесса, биологическая роль. Гипераммониемия.

Катаболизм аминокислот в тканях происходит постоянно со скоростью ∼100 г/сут. При этом в результате дезаминирования аминокислот освобождается большое количество аммиака.

Источники аммиака: 1-неокислительное дезаминирование некоторых АК (серина, треонина, гистидина) – в печени; 2-окисл. дезаминирование глутаминовой кислоты– во всех тканях (кроме мышц); 3-дезаминтрование амидов глутаминовой к-ты и аспарагиновой к-ты – в печени и почках; 4- катаболизм биогенных аминов – во всех тканях; 5-жизнед-ть бактерий (гниение белков в кишечнике); 6- распад пуриновых и пиримидиновых оснований – во всех тканях.

Аммиак – очень токсическое соединение, поэтому существуетт несколько способов его обезвреживания.

1)связывание аммиака с образованием нетоксичных соединений, которые выводятся с мочой. Основной реакцией связывания аммиака, протекающей во всех тканях организма, является синтез глутамина под действием глутаминсинтетазы:

Глутамин легко транспортируется через клеточные мембраны путём облегчённой диффузии и поступает из тканей в кровь. Основными тканями-поставщиками глутамина служат мышцы, мозг и печень. С током крови глутамин транспортируется в кишечник и почки.

В клетках кишечника под действием фермента глутаминазы происходит гидролитическое освобождение амидного азота в виде аммиака:

Образовавшийся в р-ии глутамат подвергается трансаминированию с пируватом. Аминогруппа глутаминовой кислоты переносится в состав аланина. Большие количества аланина поступают из кишечника в кровь воротной вены и поглощаются печенью. Около 5% образовавшегося аммиака удаляется в составе фекалий, небольшая часть через воротную вену попадает в печень, остальные ~90% выводятся почками.

2) В почках также происходит гидролиз глутамина под действием глутаминазы с образованием аммиака. В почках образуется и выводится около 0,5 г солей аммония в сутки

3) Ещё одной реакцией обезвреживания аммиака в тканях можно считать синтез аспарагина под действием аспарагинсинтетазы. Однако такой путь обезвреживания аммиака в клетках человека используется редко и к тому же требует больших энергетических затрат (энергию двух макроэргических связей), чем синтез глутамина.

4)Наиболее значительные количества аммиака обезвреживаются в печени путём синтеза мочевины.

Биосинтез мочевины

Мочевина (карбамид) - полный амид угольной кислоты - содержит 2 атома азота.

1)Источником одного из них является аммиак, который в печени связывается с диоксидом углерода с образованием карбамоилфосфата под действием карбамоилфосфатсинтетазы I.

2)Далее под действием орнитинкарбамоилтрансферазы карбамоильная группа карбамоилфосфата переносится на α-аминокислоту орнитин, и образуется другая α-аминокислота – цитруллин.

3) В следующей реакции аргининосукцинатсинтетаза связывает цитруллин с аспартатом и образует аргининосукцинат (аргининоянтарную кислоту). Этот фермент нуждается в ионах Mg2+. В реакции затрачивается 1 моль АТФ, но используется энергия двух макроэргических связей. Аспартат - источник второго атома азота мочевины

4) Далее фермент аргининосукцинатлиаза (аргининосукциназа) расщепляет аргининосукцинат на аргинин и фумарат, при этом аминогруппа аспартата оказывается в молекуле аргинина. Аргинин подвергается гидролизу под действием аргиназы, при этом образуются орнитин и мочевина. Кофакторами аргиназы являются ионы Са2+ или Мn2+. Высокие концентрации орнитина и лизина, являющихся структурными аналогами аргинина, подавляют активность этого фермента:

Образующийся орнитин взаимодействует с новой молекулой карбамоилфосфата, и цикл замыкается. Первые две реакции процесса происходят в митохондриях гепатоцитов. Затем цитруллин, являющийся продуктом этих реакций, транспортируется в цитозоль, где и осуществляются дальнейшие превращения.

Суммарное уравнение синтеза мочевины:

СО2 + NH3 + Аспартат + 3 АТФ + 2 Н2О → Мочевина + Фумарат + 2 (АДФ + Н3Р04) + АМФ + H4P2O7.

Нарушение реакций обезвреживания аммиака может вызвать повышение содержания аммиака в крови - гипераммониемию, что оказывает токсическое действие на организм. Все симптомы гипераммониемии - проявление действия аммиака на ЦНС.