Маскевич а. В., Соловьева и. В. Динамика содержания оксида азота в слезной жидкости у пользователей мягких контактных линз Научный руководитель д-р мед. Наук, доцент Бойченко п .К.

Кафедра медицинской химии

ГУ «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки», г. Луганск

Актуальность. Мягкие контактные линзы – наиболее популярный способ коррекции миопии, в связи с чем изучение влияния мягких контактных линз на метаболические процессы в тканях глаза является актуальным.

Известно, что в ответ на механически индуцированное повреждения эпителия во время ношения мягких контактных линз, передние кератоциты подвергаются апоптозу. Процесс апоптоза контролируется разнообразными клеточными сигналами, которые когут как положительно, так и отрицательно индуцировать апоптоз.

В ходе исследований установлено, что у пользователей мягких контактных линз усиливается активность синтеза оксида азота.

Известно, оксид азота оказывает ингибирующее действие на пролиферативную активность как нормальных, так и опухолевых клеток. Ингибирование пролиферативной активности клеток часто коррелирует с увеличением апоптотической гибели. В ряде работ показано, что доноры оксида азота или активаторы индуцибельной NO-синтазы ингибируют пролиферацию клеток и индуцируют апоптоз. Так же было доказано участие оксида азота в регуляции апоптоза тканей глаза.

Цель: изучить уровень оксида азота (NO) в слезной жидкости лиц, использующих для коррекции миопии мягкие контактные линзы.

Материалы и методы. В исследовании участвовали 50 добровольцев-миопов, возрастом от 18 до 45 лет, являющихся пользователями мягких контактных линз. Обследуемые были распределены по опыту ношения линз (в месяцах и годах): до 1 года, от 1 до 4 лет, 5 – 7 лет, 8 – 10 лет, а также по гибкости ношения МКЛ (часов в сутки): до 2-х часов, от 2-х до 5-ти часов, от 6-ти до 9-ти часов, 10 и более часов. Группу контроля составили 20 добровольцев-миопов, никогда не использовавших контактную коррекцию. Всем обследуемым проводилось традиционное офтальмологическое обследование. Забор слезной жидкости производился в количестве 0,1 мл в области нижнего свода коньюктивы, без анестезии роговицы. Забор слезы производился под биомикроскопическим контролем с помощью канюли и инсулинового шприца, избегая контакта с краем века и поверхностью роговицы. Слезную жидкость переносили в микропробирки для оценки оксида азота. Обьем пробы доводили физиологическим раствором до 1мл. Для определения концентрации нитритов использовали реактив Грисса, для определения нитратов проводили их предварительное восстановление цинковой пылью. Показатели определяли спектрофотометрически при длине волны λ=540. Контролем служил дистиллят. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия и нитрата калия. Суммарное содержание оксида азота в слезной жидкости оценивалось по сумме его стабильных метаболитов – нитритов и нитратов. Значения NO были сопоставлены с общей продолжительностью ношения МКЛ и ежесуточной длительностью их использования.

Результаты и их обсуждение. Во всех экспериментальных и контрольных образцах слезной жидкости было определено содержание оксида азота, которое рассчитывали как сумму нитратов и нитритов. Нашим исследованием установлено, что средний уровень NO у пользователей мягких контактных линз составил 127.4 ± 69.6 ммоль/л, что превышало уровень NO в контрольных пробах на 57%. Увеличение среднего уровня NO у тех, кто носит контактные линзы, по сравнению с контрольной группой было статистически значимым (р<0,001).

Интересным было и то, что средний уровень оксида азота у пользователей контактных линз, существенно не изменялся в зависимости от общей продолжительности их ношения (в годах) и от ежесуточного времени их использования (P> 0,001). Минимальное превышение значений NO определялось у той группы добровольцев, которые пользовались контактными линзами не более 2-х часов в сутки – на 40,5%. Максимальные значения были получены на первом году использования контактной коррекции – повышение уровня NO на 70,5%.

Изменение уровня оксида азота в слезе можно рассматривать как косвенные показатели активации процессов апоптоза в клетках роговицы у лиц, использовавших контактные линзы, по сравнению с теми, кто вообще не использует контактную коррекцию. Это подтверждается тем, что уровни NO существенно не меняются в зависимости от опыта ношения линз в годах и среднесуточного времени ношения линз в часах.

Исходя из полученных результатов можно предположить, что повышение уровня оксида азота в слезной жидкости пользователей МКЛ, стимулирует процесс апоптоза.

Однако нужно помнить, что сам механизм апоптоза в допустимом объеме тоже физиологичен для клеток роговицы и конъюнктивы и позволяет сохранить нормальное постоянство клеточного состава этих структур.

Учитывая полученные результаты, необходимы дальнейшие исследования, чтобы в полной мере объяснить влияние изменений в уровнях NO в слезной жидкости, на активность апоптотических процессов в роговице у пользователей контактных линз.

Выводы. У пользователей мягкими контактными линзами усиливается активность синтеза оксида азота, что может стимулировать апоптоз кератоцитов. Динамика показателей уровня оксида азота в слезной жидкости может явиться маркером для изменения срока ношения МКЛ, количества часов в течение суток или полного отказа от контактной коррекции.

УДК 577.121:611-018.16:616-092.9

Клименко А. Е., Демьяненко Е. В.

ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ СВОБОДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ОКСИДА АЗОТА В КУЛЬТУРЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРЫС, КУЛЬТИВИРОВАННЫХ В

АПОПТОЗ-ИНДУЦИРОВАНОМ ОКРУЖЕНИИ

Научный руководитель д-р мед. наук, доцент Бойченко П. К.

Кафедра медицинской химии

ГУ «Луганский государственный медицинский университет имени

Святителя Луки», г. Луганск

Актуальность. Проблема изучения культивирования, пролиферации и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток является важным разделом прикладной науки во всём мире. В последние десятилетия учёными детально изучается возможность использования МСК в практике лечения различных заболеваний. Подобно гемопоэтическим, мезенхимальные стволовые клетки составляют небольшую часть клеток костного мозга, однако, в определённых условиях при культивировании in vitro они активно пролиферируют, не вступая в дифференцировку. Это даёт возможность изучить влияние различных факторов и веществ на процессы роста, дифференцировки и гибели данных клеток, а также, особенности их метаболизма. Особое место занимает вопрос возможности «обучения» стволовых клеток, с использованием различных стимулирующих агентов, для более быстрой и точной дифференцировки их в требующуюся ткань.

Одним из универсальных регуляторов метаболических процессов в клетках и тканях живого организма является оксид азота (NO). Это маленькая липофильная молекула с дихотомическими регуляторными ролями во многих биологических процессах при физиологических и патологических состояниях. NO является промотором апоптоза (проапоптоз) в одних клетках и ингибитором апоптоза (антиапоптоз) – в других.

Результаты экспериментальных работ свидетельствуют о том, что апоптоз может играть критическую роль в ряде почечных патологий.

Цель: определить содержание стабильных метаболитов оксида азота в культурах мезенхимальных стволовых клеток, культивированных в условиях различного окружения.

Материалы и методы. Для исследования получали клетки костного мозга путём промывания полости бедренной кости взрослых лабораторных крыс. Клетки культивировали в среде Игла МЭМ с добавлением сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота в течение 14 дней со сменой питательной среды 1 раз в неделю. Жизнеспособность клеток в культуре определяли по тесту с трипановым синим. Было выделено две опытных группы: контрольную (клетки культивировали в стандартных условиях на обычной питательной среде) и экспериментальную (клетки культивировали на питательной среде с добавлением гомогената почечной ткани крыс, перенесших экспериментальную острую почечную недостаточность). Острая почечная недостаточность создавалась интаоперационно на модели ишемия/реперфузия на белых беспородных крысах массой 200-250 грамм, возрастом 16 недель, которые содержались в стандартных условиях вивария и перед вступлением в эксперимент проходили 14-ти дневный карантин. Животных оперировали под тиопенталовым наркозом, с двусторонним пережатием почечных ножек на 30 минут. Забор почек проводился на 3 сутки после операции в стерильных условиях. Культуры клеток исследовались на 3, 7, 14 сутки культивирования.

Для проведения анализа метаболитов оксида азота нами использовалась методика, позволяющая определить содержание нитрит-ионов и суммарное количество NO, с использованием диазотирования на основе реактива Грисса. Нитриты определяли спектрофотометрически. Результаты обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики на персональном компьютере с помощью пакетов “Excel” и “Start Graf”.

Результаты и их обсуждение. Исследованием установлено, что в группе контроля на 7 сутки культивирования количество нитрит-анионов (NO₂) уменьшилось по сравнению с 3 сутками на 24%, на 14 сутки отмечалось увеличение количества нитрит-аниона на 34% по сравнению с 3 сутками культивирования и на 12,5 % по сравнению с 7 сутками соответственно. Вероятно, это связано с тем, что при увеличении времени культивирования в культуре клеток развиваются гипоксические процессы, стимулирующие активность NO-синтаз (NOS), что объясняет повышение содержания NO₂. В экспериментальной группе на 3 сутки культивирования увеличивалась концентрация нитрит-аниона в 2,3 раза по сравнению с контролем, на 7 сутки его продукция превышала показатели контрольной группы в 3,3 раза, а к 14 суткам – в 1,7 раза.

При оценке генерации нитрат-анионов (NO₃) в этих же опытных группах нами была получена схожая динамика результатов. Так на 7 сутки культивирования клеточной культуры уровень нитрат-анионов в контрольной группе снизился на 4% относительно 3 суток, а к 14 суткам культивирования – повысился на 4% относительно 3 суток и на 9,9% относительно 7 суток культивирования.

В экспериментальной группе на 3 сутки культивирования наблюдалось увеличение концентрации нитрат-аниона в 2 раза по отношению к контролю. На 7 сутки его продукция превышала показатели контрольной группы в 2,2 раза, а к 14 суткам – в 1,7 раза.

Таким образом, исследованием было установлено повышение продукции свободных метаболитов оксида азота в культуре клеток, выращенных в условиях апоптоз-индуцированного окружения на все сутки культивирования относительно контрольной культуры клеток. Это может свидетельствовать об активации гипоксических процессов в культуре клеток, культивированных в среде с внесенными активно апоптозирующими клетками почечной ткани, перенесшей ишемическое поражение, запуск процессов запрограммированной гибели в мезенхимальных стволовых клетках имеющимися в среде проапоптотическими агентами.

Выводы. Увеличение времени культивирования мезенхимальных стволовых клеток приводит к развитию в культуре гипоксических процессов и увеличению продукции клетками свободных метаболитов оксида азота.

Внесение в питательную среду для культивирования мезенхимальных стволовых клеток фрагментов ишемизированных тканей приводит к повышению уровня нитрит- и нитрат-анионов в клеточной культуре.

Увеличение концентрации свободных метаболитов оксида азота в культуре мезенхимальных стволовых клеток, культивированных в апоптоз-индуцированном окружении прямо пропорционально длительности культивирования.

УДК 159.944:61-057.875