Окраска мазков по Граму

Из сложных методов наибольшее практическое значение имеет метод окраски по Граму. Этот метод позволяет разделить все микробы на грамположительные (грампозитивные), и грамотрицательные (грамнегативные).

Метод окраски по Граму

1) на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую наносят раствор карболового генцианвиолета на 2 минуты;

2) пинцетом удаляют бумагу, краску сливают и не промывают водой;

3) наносят раствор Люголя на 2 минуты;

4) сливают раствор Люголя;

5) наносят йодированный спирт на 2 мин. (или 96^о этиловый спирт 30 сек.);

6) промывают мазок водой;

7) докрашивают фуксином Пфейфера 2 минуты;

8) краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стенки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствором Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате краситель оказывается как бы «запертым» и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тонкий и не оказывает существенного влияния на проницаемость клеточной стенки; кроме того, они содержат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет.

Модификация метода Грама по Синёву. В настоящее время широкое применение в практике бактериологических исследований нашел видоизмененный способ окраски по Граму, предложенный Синёвым. Раствор основного красителя заменяют фильтровальной бумагой пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллвиолета. На препарат помещают окрашенную бумагу и наносят на нее 2-3 капли воды. Окрашивание идет в течение 2 минут, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым методом.

Фуксин Пфейфера можно заменить аналогично изготовленной красящей фильтровальной бумагой.

Окраска кислото-спирто-щелочеустойчивых микроорганизмов

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Мyсobacterium. Среди них встречаются непатогенные (обитающая в сене и впервые обнаруженная в трафе-тимофеевке палочка тимофеевой травы, смегмозная палочка и др.), которые обнаруживают в масле, молоке, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных (Myсobacterium tuberculosis), возбудителя паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота (Мyсobacterium paratuberculosis), возбудителя проказы (лепры) у человека (Мyсobacterium leprae).

У рыб болезни, вызываемые микобактериями, называются микобактериозы. Болезнь поражает самых различных рыб. Болезнь чаще протекает хронически, реже в острой форме, когда во внутренних органах обнаруживаются массовые скопления возбудителя. Заражение проходит при заглатывании бактерий с водой, у лососевых при поедании заболевших и погибших рыб. Установлено, что у живородящих тропических рыб наблюдается трансовариальный путь заражения- через зародышей, в которых развивается бактерия. В отношении рыб, мечущих икру, этот путь не доказан.

После обнаружения у рыб микобактерий в литературе высказывались предположения по поводу возможности распространения рыбами туберкулеза человека. Исследования последних лет показали несостоятельность этого предложения, однако было установлено, что при некоторых условиях микобактерии пойкилотермных животных могут сохраняться у теплокровных, и наоборот.возбудителем тубекулеза человека и теплокровных животных являются бактерии, относящиеся к тому же роду Мyсobacterium.

Клинические признаки не очень характерны. Заболевшие рыбы теряют аппетит, теряют в весе, окраска тела становится бледнее, наблюдаются дефекты чешуи и иногда появляютя язвы, разрушение плавников, пучеглазие и выпадание глазного яблока. У лососевых отмечены более яркая окраска тела и недоразвитие вторично-половых признаков.

При вскрытии рыб в печени, реже в почках и селезенке, обнаруживаются так называемые псевдоцисты в виде сероватых узелков, очень напоминающие капсулу гриба Ichthyosporidium. Псевдоцисты содержат скопление лейкоцитов, фагоцитировавших бактерий, а также самих бактерий. При остром течении болезни микобактерии выявляются на нативных и окрашенных мазках крови, взятой из внутренних органов. В некоторых случаях наблюдается скопление экссудата в плавательном пузыре и полости тела.

Диагноз ставится комплексно, учитывая клиничерезультаты ские данные, патологоанатомического вскрытия и подтверждается лабораторными методами. Особенно тщательно микобактериозы должны быть отдифференцированы от ихтиоспоридиоза. Дифференциальный диагноз может быть поставлен по наличию или отсутствию в псевдоцистах микобактерий..

В качестве возбудителей зарегистрированы многочисленные виды рода Мyсobacterium, однако в 9-ом издании Берджи оставлены 2 вида: Мyсobacterium marinum, Мyсobacterium fortuitum. Все остальные рассматриваются как синонимы.

Изучение микобактерий представляет интерес и с эпидемиологической точки зрения, так как доказано, что Мyсobacterium marinum может вызывать инфекцию у теплокровных животных и человека. На коже людей на месте внедрения появляются локальные эритемодермальные папулы. Входными воротами служат различные ссадины,раны. Особую опастность представляет рыбоводам,владельцам декоративных аквариумов и потребителей.

Все они палочковидные бактерии, грамположительные, неподвижные. Характерной особенностью является сильно выраженная кислотоустойчивость.

Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и наличием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие растворы. Поэтому применяют красители с протравителями и нагреванием мазка над пламенем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.

Метод окраски по Цилю-Нильсену.

1. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят карболовый фуксин Циля и нагревают до появления паров в течение 2-3 мин.

2. Бумагу удаляют пинцетом.

3. Препарат обесцвечивают 5% раствором Н₂SО₄ - 5 секунд.

4. Тщательно промывают водой.

5. Докрашивают метиленовым синим (Лёффлера) 2- 3 минуты.

6. Мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под иммерсией.

Микрокартина: клетки ткани и некислотоустойчивые бактерии – синие, микобактерии – красные.

Решающим дифференцирующим фактором в этом методе является воздействие на мазок серной кислоты, после чего некислотоустойчивые бактерии легко обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим.