Приготовление красящих растворов

В микробиологической практике для окрашивания микробов чаще всего применяют анилиновые красители. Различают краски основные, кислые и нейтральные. Микробы лучше окрашиваются основными красителями.

Наиболее часто используют:

фиолетовые – генциановый фиолетовый (генцианвиолет), метиловый фиолетовый (метилвиолет), кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет).

красные – фуксин основной, фуксин кислый, нейтральный красный (нейтральрот), сафранин.

синие – метиленовый синий, водный синий.

зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый.

Кроме перечисленных красок в бактериологии применяют сложные красители, представляющие собой нейтральную смесь. Примером такой сложной краски является краска Романовского-Гимза, в состав которой входят три красителя: азур, эозин и метиленовый синий, сохраняющие свое избирательное действие.

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые, спиртово-водные и водные растворы красок. Для усиления действия в растворы красителей добавляют фенол, щелочи и подогревают мазки при окрашивании.

Для приготовления концентрированных спиртовых растворов красок в 10 см³ 96^о этилового спирта растворяют 1 г краски и помещают на сутки в термостат. Краски хранят в темных флаконах.

Приготовление растворов:

Карболовый (феноловый) генцианвиолет - к 10 см³ концентрированного раствора краски добавляют 90 см³ 2% водного раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Карболовый (феноловый) фуксин Циля – к 10 см³ концентрированного раствора краски основного фуксина добавляют 90 см³ 5% раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Водный фуксин Пфейфера – к 10 см³ фенолового фуксина Циля добавляют 90 см³ дистиллированной воды. Эта краска нестойкая и поэтому ее готовят каждый раз перед применением (ex temporо).

Метиленовый синий Леффлера – к 30 см³ спиртового раствора краски добавляют 100 см³ дистиллированной воды и 1 см³ 1% водного раствора КОН.

Водные растворы красок готовят на дистиллированной воде в концентрациях 0,5-5%, доводят их до кипения и фильтруют. Водные растворы красок нестойки, поэтому их не следует готовить впрок.

Для окраски по Граму используют раствор Люголя – 1 г кристаллического йода + 2 г йодистого калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды.

Морфология микроорганизмов

Основными морфологическими признаками микробов являются – форма, величина, подвижность, расположение в мазке, особенности внутренней структуры (наличие спор, капсул, биполярности).

I. Форма микроорганизмов.

Кокки могут быть сферической, овальной, бобовидной формы. Для различных видов кокков характерно своеобразное расположение клеток, связанное со способом деления:

микрококки – (от лат. «micros» - маленький) расположены беспорядочно. В диаметре не превышают 0,5 мкм (например, Micrococcus luteus);

диплококки – (от греч. «diploоs» - двойной) располагаются попарно (например, Streptococcus pneumoniae) делятся в одной плоскости;

стрептококки - (от греч. «streptos» - цепочки) – располагаются в виде цепочек различной длины (например, Streptococcus equi), деление происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются;

тетракокки – (от греч. «tetra» - четыре) располагаются по четыре, деление происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях (например, Aеrococcus viridans);

стафилококки – (от греч. «staphyle» - гроздь винограда) образуют беспорядочное скопление клеток, напоминающие гроздь, делятся в различных направлениях без особой закономерности (например, Staph. aureus);

сарцины - (от лат. «sarcio» - связываю) кокки, располагающиеся объемными пакетами по 8, (например, Sarcina ureae). Деление происходит в 3-х взаимоперпендикулярных плоскостях (Рис. 4).

Рис. 4 (По Ереминой В.А., 1998). Взаимные расположения кокков: а - микрококки; б - диплококки;

в - стрептококки; г - тетракокки; д - стафилококки; е - сарцины

Палочковидные бактерии имеют форму вытянутого цилиндра и различаются:

• размерами (длиной и толщиной); средняя длина палочковидных бактерий составляет 2–7 мкм при диаметре 0,5–1 мкм. Однако есть как значительно более крупные формы, так и очень мелкие, величина которых находится на грани видимости в обычные световые микроскопы (0,1–0,2 мкм);

• взаимным расположением клеток; палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке, попарно (диплобактерии) и цепочками (стрептобактерии);

• по форме клеток и их краям (тонкие, толстые, короткие, длинные, с обрубленными, с закругленными краями, в виде булавы и веретена);

• палочки бывают спорообразующие и неспорообразующие;

• палочковидные бактерии бывают подвижные и неподвижные; клетки подвижных форм палочковидных бактерий снабжены специальными приспособлениями для движения – жгутиками.

Палочковидные микроорганизмы подразделяют на:

бактерии – микробы, не образующие спор (например, возбудитель колибактериоза – кишечная палочка - Escherichia coli);

бациллы - спорообразующие палочки, диаметр спор которых меньше диаметра клетки. По типу дыхания бациллы - аэробы, для своего развития нуждаются в свободном молекулярном кислороде (например, возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis и сенная палочка – Bacillus subtilis).

клостридии – спорообразующие палочки, диаметр спор у них больше диаметра клетки. поэтому при образовании споры форма клетки меняется и приобретает вид веретена (клостридиальное расположение споры) или барабанной палочки (плектридиальное расположение споры). По типу дыхания клостридии - анаэробы, для размножения не нуждаются в кислороде воздуха (например, возбудитель столбняка – Clostridium tetani, ботулизма – Clostridium botulinum) (Рис. 5).

Рис. 5. (По Ереминой В.А., 1998). Морфология палочковидных бактерий: А - диплобактерии;

б - стрептобактерии; в - бациллы; г - клостридии

Извитые микроорганизмы подразделяют на:

вибрионы - изогнутые палочки, имеющие форму «запятой», т.е. 0,5 -0,25 завитка (например, возбудитель холеры - Vibrio chоlerae, возбудитель пищевого отравления при потреблении недоброкачественной рыбы и морепродуктов – Vibrio parahaemoliticus (парагемолитический вибрион);

спириллы - микроорганизмы с несколькими крупными завитками (2-4 завитка) (например, возбудитель лихорадки Lassa – «болезни укусов крыс», Spirillum minus);

спирохеты - это особые микроорганизмы с множеством мелких завитков вдоль осевой нити (например, возбудитель лептоспироза – Leptospira interrogans);

а б. .

Рис. 6. Морфология извитых бактерий: а – вибрионы; б - спириллы; в – спирохеты.

Все извитые формы подвижны. Движение осуществляется с помощью жгутиков (вибрионов и спирилл) или за счет сокращения всей клетки (у спирохет). Рис. 6.

Ветвящиеся формы бактерий. Способность к ветвлению отмечена у прокариот из группы актиномицетов. Актиномицеты (лучистые грибки) – представляют собой особую группу бактерий. У некоторых видов переплетение нитей образует мицелий, подобный мицелию гриба. Клетки актиномицетов имеют признаки и бактерий и грибов, но в отличие от последних, имеют прокариотическое строение. Иногда тенденцию к ветвлению проявляют и другие бактерии.

Кроме этих наиболее распространенных в природе форм бактерий, в почве и водоемах обнаружены новые формы бактерий: торроиды, бактрии с простеками, нитчатые бактерии.

Торроиды имеют вид разомкнутого или замкнутого кольца.

Бактерии с простеками. Простеки (от греч. prostheke — добавление, дополнение), цитоплазматич. выросты или выступы у некоторых бактерий, ограниченные клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Форма нитчатая, шиповидная или сферическая. Характерны для простекобактерий, стебельковых бактерий, гифомикробов, некоторых зелёных бактерий. У почкующихся бактерий участвуют в репродукции клеток. Предполагают также, что простеки увеличивают клеточную поверхность, прикрепляют клетки к различным. субстратам, участвуют в конъюгации бактерий рода (Caulobacter).имеют форму шестиугольной звезды, розетки, клетки с выростами.

Нитчатые бактерии – типичные водные организмы. Нити их имеют толщину в среднем 1–7 мкм.

Рис.7.(По Ерёминой И.А., 1998) . а) торроиды; б) бактерии с простеками; в) нитчатые бактерии; г) актиномицеты.

Нитчатые формы бактерий.

Нитчатые формы бактерий или трихомные, (гр. trichoma – волосы) – это в большинстве случаев палочковидные клетки, которые соединяются в длинные цепочки, объединяемые либо слизью, либо чехлами-влагалищами, либо плазмодесмами (мостиками), или общей оболочкой. Обычно снаружи трихом покрыт дополнительными оболочками, которые не участвуют в образовании перегородок между клетками. В большинстве случаев клетки трихом палочковидны, но у цианобактерий в тонких нитях – цилиндрические клетки, в толстых – дисковидные. Нити трихомных бактерий могут быть свободноплавающими или прикрепленными к субстрату. Примером таких бактерий являются представители родов Beggiatoa, Thioploca (свободноплавающие).

Одноклеточные формы способны осуществлять все функции, присущие организму, независимо от соседних клеток. Многие одноклеточные прокариоты склонны к образованию клеточных агрегатов, часто скреплённых выделяемой ими слизью, эти агрегаты получили название биоплёнки. Чаще всего это лишь случайное объединение отдельных организмов, но в ряде случаев временное объединение связано с осуществлением определённой функции, например, формирование плодовых тел миксобактериями делает возможным развитие цист, при том, что единичные клетки не способны их образовывать. Подобные явления наряду с образованием одноклеточными эубактериями морфологически и функционально дифференцированных клеток — необходимые предпосылки для возникновения у них истинной многоклеточности.