8. Определение фосфатазы, пероксидазы.

Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кислоты ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присутствии окислителя дает розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Творог необходимо развести дистиллированной водой. Для этого 1 г творога помещают в пробирку и тщательно перемешивают с 2 см дистиллированной воды.

К 3 см творога добавляют 2 см рабочего раствора субстрата. Затем перемешивают содержимое пробирки и ставят в водяную баню, нагретую до 40-45°С на 30 мин. В пробирку, вынутую из водяной бани, добавляют 5 см осадителя системы цинк-медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова ставят в водяную баню с температурой 40-45 °С на 10 мин.

Вынув пробирку из бани, производят визуальное сравнение содержимого пробирки испытуемого продукта с контрольным опытом. Контрольным опытом для всех продуктов является аналогичная реакция с кипяченым молоком.

Если контрольный опыт с кипяченым молоком дает слабо-розовое окрашивание - динатрий-фенил-фосфат подлежит дополнительной очистке. При отсутствии фермента фосфатазы в продукте окраска содержимого пробирки (раствора, отделившегося от осажденного белка) бесцветная, т.е. аналогичная содержимому пробирок контрольного опыта. Следовательно, творог подвергался пастеризации при температуре не ниже 63 °С.

При наличии фосфатазы содержимое пробирок (раствор) имеет окрашивание от розового до темно-красного цвета. Следовательно, творог не подвергался пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 63 °С или были смешаны с непастеризованными молочными продуктами. При оценке реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора.

Творог на пастеризацию исходного сырья - молока и сливок определяют по фосфатазе не позднее семи суток с момента выработки творога. 

9. Определение пестицидов.

10 г творога растирают с 10 см насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см. Приливают 80 см ацетона, встряхивают 2 мин, прибавляют 100 см хлороформа и вновь встряхивают.

5 см очищенного экстракта из колбы переносят в градуированную пробирку и выпаривают на водяной бане при температуре (50±2) °С до объема 0,2 см. Этот объем при помощи микропипетки наносят на стеклянную пластинку со слоем сорбента на расстоянии 15 мм от края в одну точку так, чтобы диаметр пятна (след от нанесения раствора) не превышал 10 мм. Колбу ополаскивают 5 смдиэтилового эфира, который переносят в ту же градуированную пробирку, упаривают до объема 0,2 см на водяной бане при температуре 35-40 °С и наносят его в центр первого пятна. Справа и слева от места нанесения пробы на расстоянии 20 мм наносят стандартные растворы смеси пестицидов, содержащие 1,0 или 10,0 мкг препарата. Для этого стандартный раствор разбавляют в 10-100 раз. Пластинку с нанесенными растворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30 мин до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель--гексан. Край пластинки с нанесенными растворами может быть погружен в подвижный растворитель не более чем на 5 мм. После того, как фронт растворителя поднимается на 100 мм, пластинку вынимают из камеры и оставляют на 2-3 мин для испарения растворителя. Пластинку опрыскивают из пульверизатора проявляющим реактивом, приготовленным по п.2.3.1, и облучают 10-15 мин ультрафиолетовым светом, держа пластинки на расстоянии 200 мм от ртутно-кварцевой лампы ПРК-4. При наличии хлорорганических пестицидов на пластинке появляются пятна серо-черного цвета.

Количественное определение пестицидов производят сравнением размера пятна пробы с размером пятна стандартного раствора. Сравнение раз меров пятен производят визуально или измерением их площадей. При расчете содержания пестицида в пробе предполагают, что между количеством препарата в пробе и площадью его пятна на пластинках существует прямая зависимость. Эта зависимость соблюдается лишь при содержании пестицидов до 10 мкг в пробе.

10. Определение микробиологических показателей: - бактерий группы кишечных палочек .

Метод определения БГКП по признакам роста на жидкой среде Кесслер основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу собразованием газа и кислоты при температуре (37 ±1) °С в течение 24 ч. Признак роста БГКП на жидкой среде Кесслер - визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке.

Посев продуктов или их разведений в жидкую среду Кесслер, проводят в количестве от 0,1 до 0,001 г.

По 1 см³ соответствующих разведений продукта засевают в пробирку с 5см³ жидкой среды Кесслер. Каждое разведение засевается в одну пробирку со средой.

Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при (37 ±1) °С на 18-24 ч.

При снятии результатов пробирки или колбы с посевами просматривают и визуально определяют наличие или отсутствие газа в поплавках.

При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в данном объеме продукта. - дрожжей, плесеней.

Из подготовленной пробы продукта и (или) его разведения отбирают навеску объемом (1±0,1) см. Продукт и (или) его разведения высевают параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до температуры (45±1) °С. Параллельно с этим заливают чашку Петри 15-20 см среды для проверки ее стерильности. Посевы термостатируют при температуре (24±1) °С в течение 5 сут, посевы на чашках Петри термостатируют дном вверх. Через 3 сут термостатирования проводят предварительный учет типичных колоний или появления характерных признаков роста на жидких питательных средах. Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 сут проводят окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и

плесневых грибов разделяют визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде сопровождается появлением мути, запаха брожения и газа.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов. 11. Обнаружение растительных жиров и масел в жировой фазе продукта газожидкостной хроматографией.

В пластиковую или стеклянную бутыль вместимостью 500 см помещают (200,0±0,1) г продукта и добавляют 300 см смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:1 (по объему). Бутыль закрывают крышкой, закрепляют на лабораторном перемешивающем устройстве и перемешивают в тече ние 0,5-1,0 ч.

Полученный экстракт фильтруют в стакан вместимостью 200 см через сухой складчатый фильтр. Для отделения жировой фракции стакан помещают на 1 ч на водяную баню или в сушильный шкаф при температуре (50±2) °С.

Вносят (10±1) мг дигитонина стерина в пробирку и добавляют 0,5 см смеси формамида и диметилформамида (1:1 по объему). При необходимости раствор осторожно подогревают. Добавляют 2,5 см н-пентана в охлажденный раствор, закрывают пробирку пробкой и перемешивают интенсивным вращением. Оставляют в покое до расслоения и используют для анализа верхний слой, содержащий свободные стерины. Расчетное значение массовой концентрации стеринов в верхнем слое раствора 1 мг/см.

Подключают детектор, зажигают пламя и регулируют скорость подачи водорода и кислорода (или воздуха) так, чтобы высота пика хроматограммы холестерина была не менее 50 % верхнего предела регистрации записывающего устройства.

Включают записывающее устройство, подбирают скорость записи и устанавливают перо самописца на нулевую отметку. Подачу водорода, кислорода и включение записывающего устройства проводят в соответствии с инструкцией к прибору.

Вводят в колонку от 3·10 до 5·10 см раствора по 10.1 и записывают хроматограмму. Для более точного определения последовательно проводят запись четырех хроматограмм. Первую и третью хроматограмму записывают для раствора контроля чувствительности; вторую и четвертую - для раствора, приготовленного по Объемы растворов должны быть одинаковыми.

Если на хроматограмме наблюдаются пики с временем удерживания, характерным для ситостеринов, и их высота более 2% верхнего предела измерений, установленного по раствору для контроля чувствительности обнаружения стеринов молочного жира (1 мг свежеприготовленных стеринов молочного жира и 1 см н-пентана), то это подтверждает наличие ситостеринов в анализируемой пробе. Присутствие на хроматограмме пика ситостерина или других фитостеринов подтверждает наличие в пробе продукта растительных масел или жиров.