Генная инженерия в промышленной биотехнологии фармацевтических препаратов

Термин "новая" биотехнология в противоположность "старой" биотехнологии применяют для разделения биопроцессов, использующих методы генной инженерии, новую биопроцессорную технику, и более традиционные формы. Так, обычное производство спирта в процессе брожения - "старая" биотехнология, но использование в этом процессе дрожжей, улучшенных методами генной инженерии с целью увеличения выхода спирта - "новая" биотехнология.

Генетическая инжене́рия (генная инженерия) - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Геном - совокупность всех генов организма, каждый из которых отвечает за развитие определенного признака или свойства организма. Геном довольно сложен для расшифровки и понимания. Так, например, геном человека состоит примерно из 20 000 генов и каждый из них несет в себе какую-то генетическую информацию.

История развития биотехнологии

Люди выступали в роли биотехнологов тысячи лет: пекли хлеб, варили пиво, делали сыр, другие молочнокислые продукты, используя различные микроорганизмы и даже не подозревая об их существовании. Собственно сам термин "биотехнология" появился в нашем языке не так давно, вместо него употреблялись слова "промышленная микробиология", "техническая биохимия" и др. Вероятно, древнейшим биотехнологическим процессом было брожение. В пользу этого свидетельствует описание процесса приготовления пива, обнаруженное при раскопках Вавилона (1981 г.) на дощечке, которая датируется примерно 6-м тысячелетием до н. э.

В 3-м тысячелетии до н. э. шумеры изготовляли до двух десятков видов пива. Не менее древними биотехнологическими процессами являются виноделие, хлебопечение и получение молочнокислых продуктов.

Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода.

Эмпирический период или доисторический - самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет до н.э. и около 2000 лет н.э. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к разряду биотехнологических.

Известно, что шумеры - первые жители Месопотамии (на территории современного Ирака) создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством приготовления пива. Приобретенный опыт передавался из поколения в поколение, распространялся среди соседних народов (ассирийцев, вавилонян, египтян и древних индусов). В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издревле приготавливавшийся в домашних условиях. Первая дистилляция в виноделии была осуществлена в XII в.; водку из хлебных злаков впервые получили в XVI в.; шампанское известно с XVIII в.

К эмпирическому периоду относятся: получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов.

Таким образом, народы исстари пользовались на практике биотехнологическими процессами, ничего не зная о микроорганизмах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных.

Этиологический период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. (1856 - 1933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Л. Пастера (1822 – 1895 гг) - основоположника научной микробиологии.

Пастер установил микробную природу брожения, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, создал научные основы вакцинопрофилактики и др.

В этот же период творили его выдающиеся ученики, сотрудники и коллеги:

Э. Дюкло, Э. Ру, Ш.Э. Шамберлан, И.И. Мечников; Р. Кох, Д. Листер, Г. Риккетс, Д. Ивановский и др.

В 1859 г. Л. Пастер приготовил жидкую питательную среду, Р. Кох в 1881 г. предложил метод культивирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и на агаризованных питательных средах. И, как следствие этого, удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.).

Биотехнический период - начался в 1933 г. и длился до 1972 г.

В 1933 г. А. Клюйвер и А.Х. Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов», в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях.

Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939-1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами).

Все прогрессивное в области биотехнологических и технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии.

Геннотехнический период начался с 1972 г., когда П. Берг создал первую рекомбинацию молекулы ДНК, тем самым показав возможность направленных манипуляцией с генетическим материалом бактерий.

Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона по установлению структуры ДНК было бы невозможно достигнуть современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и репликации ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнических процессов на основе генноинженерных манипуляций.

За последние 20 лет биотехнология, благодаря своим специфическим методам, совершила решительный прорыв на промышленный уровень и является одной из отраслей, определяющих уровень развитости государства. Это в свою очередь, способствовало развитию новых методов исследований и интенсификации процессов, открывших ранее неизвестные возможности в получении биопрепаратов, способов выделения, идентификации и очистки биологически активных веществ.

Структура современной биотехнологии

Современная биотехнология включает ряд высоких технологий, которые базируются на последних достижениях экологии, генетики, микробиологии, цитологии, молекулярной биологии. В современной биотехнологии используются биологические системы всех уровней: от молекулярно-генетического до биогеоценотического (биосферного); при этом создаются принципиально новые биологические системы, не встречающиеся в природе. Биологические системы, используемые в биотехнологии, вместе с небиологическими компонентами (технологическое оборудование, материалы, системы энергоснабжения, контроля и управления) принято называть рабочими системами.

К основным разделам современной биотехнологии относятся: микробиологический синтез, клеточная инженерия и генная инженерия.

Микробиологический синтез (МБС)

Становление современного МБС связано с открытием антибиотиков и разработкой способов их промышленного производства с помощью актиномицетов и грибов. В настоящее время микроорганизмы используются в различных высоких технологиях: для производства антибиотиков, кормового белка и аминокислот, биологически активных соединений (витаминов, гормонов, ферментов, стимуляторов роста) и т.д.

Промышленная биотехнология

Широкое проникновение биотехнологий в экономику мирового хозяйства нашло свое отражение и в том, что сформировались даже новые термины для обозначения глобальности данного процесса.

Красная биотехнология (медицина) считается важнейшей сферой использования биотехнологий. Биотехнологический метод играет все большую роль для разработки новых медикаментов (например, для лечения рака). Биотехнологии имеют большое значение также для осуществления диагностики (чипы ДНК, биосенсоры). Красная биотехнология пользуется в Австрии заслуженным признанием и по праву считается ключевой технологией и двигателем для развития других отраслей.

Зеленая биотехнология используется в сфере современной селекции растений. С помощью биотехнологических методов разрабатываются эффективные средства против насекомых, грибков, вирусов; создаются новые формулы гербицидов. Особое значение для сферы зеленой биотехнологии имеет генная инженерия. Она создает предпосылки для переноса определенных генов одного вида на другие растения и влияет, таким образом, на развитие соответствующих устойчивых свойств и характеристик полученных сортов.

Серая биотехнология применяется в сфере охраны окружающей среды. Биотехнологические методы используются для санации почв, очистки канализационных стоков, отработанного воздуха и газов, а также для переработки отходов.

Белая биотехнология охватывает сферу применения биотехнологий в химической промышленности. В задачи белой биотехнологии входят эффективное и безопасное для окружающей среды производство таких субстанций, как алкоголь, витамины, аминокислоты, антибиотики и ферменты.

Синяя биотехнология специализируется на техническом применении организмов и процессов морской биологии. В центре исследований находятся биологические организмы Мирового океана.

Всплеск исследований по биотехнологии в мировой науке произошел в 80-х годах, когда новые методологические и методические подходы обеспечили переход к эффективному их использованию в науке и практике и возникла реальная возможность извлечь из этого максимальный экономический эффект.

Гибкость метаболизма и высокая способность микробов к адаптации, простота культивирования, изученность генетики, разработанные методы направленного создания штаммов с заданными свойствами — преимущества, делающие микробную биотехнологию одним из перспективных направлений промышленности. Целесообразность промышленного производства определяется такими факторами, как высокий выход продукта (образование больших количеств из исходного материала), низкая стоимость производства и доступность сырья.

Оптимизация микробиологических процессов в биотехнологии. Принципиальные подходы к оптимизации микробных биотехнологических процессов: управляемое культивирование (изменение состава питательной среды, целевые добавки, регуляция скорости перемешивания, аэрации, модификация температурного режима и пр.); генетические манипуляции, которые подразделяют на традиционные методы (селекция штаммов) и методы генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК).

В настоящее время микробиологическим путём получают микробную биомассу, первичные и вторичные продукты метаболизма. Первичные продукты (продукты первой фазы) — метаболиты, синтез которых необходим для выживания данного микроорганизма. Синтез вторичных продуктов (продукты второй фазы) не относится к жизненно необходимым для микроорганизма-продуцента. Оптимальные условия для получения биомассы определяются высокими скоростями протока среды через культуры микроорганизмов и стабильными химическими условиями культивирования (в том числе рН, количество кислорода и углерода). Процесс получения продуктов первой фазы (в частности, ферментов) оптимизируют в целях увеличения удельной активности фермента (единиц/г*ч^-1) и объёмной продуктивности (единиц /л*ч^-1).

Для получения продуктов второй фазы (например, антибиотиков) главная задача — максимальное увеличение их концентрации, что ведёт к снижению затрат на их выделение.

Важное направление биотехнологии — культивирование растительных клеток, образующих биологически активные вещества (БАВ). Подобный подход отменяет необходимость в закладке больших плантаций лекарственных растений и связанные с этим проблемы (уход за посевами, профилактика болезней лекарственных растений), позволяя получить нужные препараты более дешёвыми методами. Таким образом получают БАВ женьшеня, строфанта и других растений.

В общем виде схема биотехнологического производства продуктов микробного синтеза представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Общая схема биотехнологического производства

Существует 5 стадий биотехнологического производства.

При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так как должны быть стерильными.

Биотехнологические процессы воспроизводства микроорганизмов могут быть основаны на периодическом или непрерывном культивировании.

Выращивание микроорганизмов, или культивирование, происходит в специальных аппаратах, так называемых биореакторах.

Биореактор, ферментер или ферментатор - это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

Этап роста культуры включает несколько фаз:

а) лаг-фазу - сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объеме биореактора;

б) экспоненциальную фазу - бурное деление клеток, сбалансированный рост культуры;

в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

г) стационарную фазу - прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания - постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальную фазу (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты) или в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. - так называемые вторичные метаболиты или идиолиты).

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой: помимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

Существует также отьемнодоливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к задержке ее перехода к фазе отмирания. Такой режим культивирования в значительной мере уподобляется непрерывному процессу, поэтому называется также полунепрерывным культивированием.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Выделяют два основных способа культивирования микроорганизмов.

Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов

Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой - составляет наибольшую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению образования целевого продукта.

Концентрация целевого продукта в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильтраты культуральных жидкостей содержат не более 3% сухих веществ. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять полученные продукты любым методом.

Поверхностный метод культивирования микроорганизмов-продуцентов

Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерилизованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растительные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация целевого продукта на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную форму и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

Требования микроорганизмов к питательным веществам

Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами.

К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции. Например, К⁺ необходим для активности большого числа ферментов и в частности, ферментов белкового синтеза. Са²⁺ определяет устойчивость бактериальных эндоспор к нагреванию. Mg²⁺ стабилизирует рибосомы, многие ферменты и клеточные мембраны. Fe²⁺ и Fe³⁺ являются частью цитохромов и кофакторами электронпереносящих белков.

Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, - это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Например, Со²⁺ является компонентом витамина В₁₂, Cu²⁺ входит в состав цитохромоксидазы и купредоксинов, Mn²⁺ активирует ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп, Мо²⁺ входит в состав нитрогеназы и нитратредуктазы, Ni²⁺ является компонентом уреазы, гидрогеназы, кофактора F₄₃₀, Zn²⁺ входит в состав карбоангидразы, ДНК- и РНК-полимераз и т.д. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей.

Биогенные элементы должны присутствовать в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Как правило, ионы металлов, сера, фосфор и микроэлементы добавляют в среду в виде минеральных солей. Минеральная основа среды (минеральный фон) практически одинакова для большинства микроорганизмов.

Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО₂, N₂, карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.). Если микроорганизму требуется набор источников углерода или азота, и тогда применяют различные экстракты и гидролизаты смеси белков и полисахаридов неопределенного состава (сусло, гидролизат молочного белка, пептон и др.).

У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas, Actinomyces), у других – достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии).

Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.

По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ – это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. В зависимости от партии зерна концентрация сахаров в сусле может быть разной. Ее выражают в градусах Баллинга (^оБ), что примерно соответствуют процентному содержанию сахаров в растворе. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.

Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель. Желатин – это белок из соединительной ткани животных, образующий гель при 25^оС. Неудобство его применения заключается в том, что температура роста многих микроорганизмов выше, чем температура плавления желатина. Наличие протеолитических ферментов у многих микроорганизмов приводит к расщеплению и разжижению желатина. Более удобен как уплотнитель сложный полисахарид агар, получаемый из морских бурых водорослей, так как большинство микроорганизмов не использует его для питания. Агар может многократно плавиться при 100^оС и застывать при 45^оС. Добавлением 2% агара в жидкую основу получают широко применяемые мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА) и бульон-сусло-агар (БСА). В качестве твердой основы для синтетических сред часто используют неорганическое соединение кремния силикагель.

По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные.

Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. В то же время следует помнить, что не существует одной среды, универсальной для всех микробных культур.

Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Создание условий, благоприятных для определенной группы микроорганизмов (элективных условий), приводит к преобладанию в смешанной популяции желаемых микроорганизмов. Рост и размножение других микроорганизмов в этих условиях незначительны.

Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма. Индикаторные среды наиболее часто используют в санитарной и медицинской микробиологии.

История генной инженерии

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируется одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в реципиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Задачи генной инженерии:

создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов

Рекомбинантные ДНК создаются для определенных научных целей

Принципы генной инженерии:

• Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

• Перенос ДНК в клетки-реципиенты

• Селекция и отбор трансформированных клеток

• Клонирование рекомбинантной ДНК в клетках хозяина

Методы генной инженерии

Метод рекомбинантных ДНК для многих специалистов является краеугольным камнем здания биотехнологии. Создание рекомбинантной ДНК буквально означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов. Успех технологии рекомбинантных ДНК (рДНК) принесло использование бактериальных ферментов, таких как:

• рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), которые разрезают молекулы ДНК в определенных местах;

• ДНК-лигазы, которые соединяют концы молекул ДНК;

• ДНК-полимеразы, которые участвуют в репликации ДНК.

Каким бы ни было применение этой технологии, конечным итогом процедуры всегда является стабильная и наследуемая экспрессия какого-либо нового признака. Применяется рДНК для модификации различных организмов, но основные этапы работы схожи.

Строение ДНК/рДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Собственно хранение наследственной информации в ДНК и синтез РНК – это основные функции ядра клетки.

ДНК организма содержит в себе всю генетическую информацию организма, называемую геномом. Геном же представляет собой совокупность всех генов организма, каждый из которых отвечает за развитие определенного признака или свойства организма. Геном – вещь отнюдь не простая для расшифровки и понимания. Так, например, геном человека состоит примерно из 20 000 генов и каждый из них несет в себе какую-то генетическую информацию.

Интерес к ДНК как носителю генетической информации резко возрос к началу 50-х годов, и структура ДНК была вскоре установлена. ДНК собрана из нуклеотидов, каждый из которых имеет фосфатную группу, связанную ковалентно с пяти-углеродным сахаром. Каждый такой сахар связан с одним из четырех азотистых оснований. История открытия структуры ДНК описана американским биохимиком Джеймсом Уотсоном в его книге «Двойная спираль» (1968 г). В Кембридже Уотсон познакомился с Криком, физиком, который переквалифицировался в биохимика. Из общения с химиками Уотсон узнал, что структурные формулы, которыми они пользовались, далеки от совершенства. Разобравшись в структуре пуринов (А, Г) и пиримидинов (Т, Ц), Уотсон и Крик решили, что они должны быть тесно связаны между собой. Если это так, то ДНК должна состоять из двух цепей. Цепи должны закручиваться между собой так, чтобы сохранялись определенные углы между группами атомов. Так возникла двойная спираль, в которой пурины и пиримидины выстроены по типу ступенек лестницы: роль "перекладин" играют основания, "веревок" - сахарофосфатные остовы. Каждая перекладинка образована из двух оснований, присоединенных к двум противоположным цепям, причем у одного из оснований одно кольцо, у другого - два. Следовательно, это может быть А и Т или Г и Ц. Поскольку в каждой паре есть одно основание с одним кольцом и одно - с двумя, величина перекладин одинаковая, и остовы цепей находятся на одном расстоянии. Две цепи удерживаются вместе водородными связями между основаниями. Статья Уотсона и Крика, в которой сообщалось о расшифровке структуры ДНК, заняла всего две странички в научном журнале, но она открыла новую эпоху в раскрытии тайны жизни. В первой же публикации (1953 г) Крик и Уотсон отметили, что такая структура хорошо объясняет и процесс "воспроизводства" этой молекулы. При рассоединении цепей возможно присоединение новых нуклеотидов к каждой из них, тогда около каждой старой возникнет новая цепь, точно ей соответствующая. Так впервые пришли к структуре, которая была способна к самовоспроизведению. Физики Крик и Уилкинс вместе с биохимиком Уотсоном стали лауреатами Нобелевской премии по физиологии и медицине за 1962 год.

Концепция создания рДНК: вектор-вставка

Вставка – это чужеродная ДНК, встроенная в вектор

Вектор – это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина с целью ее размножения и клонирования

Характеристика вектора:

Вектор должен содержать точку начала репликации (origin) для самостоятельной репликации в клетке-хозяине.

Вектор должен иметь два селективных маркера для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина

В качестве генетических векторов используют:

Плазмиды

Космиды (плазмиды, которые содержат cos-сайты фага лямбда)

Бактериофаги

Вирусы

Yac (yeast artificial chromosomes) – искусственные хромосомы дрожжей

Строение рекомбинантной ДНК.

Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий. Синтез белков происходит в клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки. Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.

Этапы сборки рДНК. Для создания молекулы рДНК, необходимо:

1. изолировать ДНК из клетки-донора (будь то животная клетка или клетка растения),

2. обработать выделенную ДНК и плазмиду (молекулу-вектор) одними и теми же рестриктазами и смешать их вместе. “Липкие концы” донорской ДНК образуют водородные связи с липкими концами плазмиды, затем происходит “сшивание” рекомбинантной молекулы с помощью лигаз.

3. Модифицированная плазмида переносится в бактерию, которая потом увеличивает копии той генетической информации, которую мы внесли в плазмиду.

Клонирование рДНК

Клонирование – это получение большого количества копий определенного гена в результате его размножения в клетках в составе рекомбинантной ДНК

Клон – это популяция клеток, которая берет начало от одной клетки

Трансформация – изменение свойств клетки в результате переноса рекомбинантной ДНК через мембрану

Скрининг – поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди десятков тысяч клонов

Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов. В тех случаях, когда векторами служат плазмиды, рекомбинантные ДНК вводят в реципиентные бактерии путем трансформации. Разработаны и методы трансформации клеток животных, а также протопластов растений. Для защиты экзогенного клеточного материала, вводимого в клетки млекопитающих или в протопласты растений, используют липосомы — сферические тельца, оболочка которых состоит из фосфолипидов. В составе липосом в клетки высших эукариот введены крупные вирусные РНК. Во всех случаях липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Генетичевкая инженерия является основой для:

• биотехнологических процессов

• картирования хромосом

• секвенирования геномов

• коррекции генома и генотерапии

Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:

– Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других).

– На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов.

– Созданы трансгенные высшие организмы (некоторые рыбы и млекопитающие, многие растения) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt-модифицированные растения, устойчивые к вредителям.

– Разработаны методы клонирования строго определенных участков ДНК, например, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-технологии применяются для идентификации определенных нуклеотидных последовательностей, что используется при ранней диагностике некоторых заболеваний, например, для выявления носителей ВИЧ-инфекции.

Возможности и перспективы генной инженерии

Возможности генной инженерии практически безграничны. В настоящее время интенсивно изучается возможность коррекции генома человека (и других организмов) при генетических и негенетических заболеваниях.

В 2000 году человеческий геном был полностью секвенирован и в настоящее время метод рекомбинантных ДНК в совокупности с методом молекулярного клонирования используется для достижения следующих целей:

– производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин;

– лечение некоторых генетических заболеваний;

– создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства;

– повышение урожайности и снижение стоимости продукции;

– снижение аллергенности некоторых продуктов;

– улучшение питательных свойств продуктов;

– разработка биодеградирующих пластмасс;

– снижение уровня загрязненности воды и воздуха;

– замедление скорости порчи пищевых продуктов;

– контроль над вирусными заболеваниями;

– снижение воспалительных реакций.

Но особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии и гибридомных методов может привести к коренным преобразованиям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время не существует адекватных методов диагностики и лечения (раковые, сердечно-сосудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные и умственные расстройства), с помощью генной инженерии и биотехнологии станут доступны и диагностике, и лечению. Под влиянием биотехнологии медицина может превратиться из преимущественно эмпирической в фундаментально теоретически обоснованную дисциплину с ясным пониманием происходящих в организме молекулярных и генетических процессов.

Генно-инженерные лекарственные препараты, появившиеся на рынке в последнее десятилетие, представляют собой естественные природные биорегуляторы и биологически активные вещества, синтез которых для медицинских целей вне организма невозможен или весьма затруднителен.

К таким препаратам относятся инсулин, гормон роста, урокиназа, факторы свертывания крови, эритропоэтин, интерлейкины и их ингибиторы, колониестимулирующие факторы и факторы роста, артериальный натрийуретический фактор, супероксиддисмутаза, ангиогенин, тканевый активатор плазминогена, вакцины, моноклональные антитела.

Современные биотехнологические разработки предусматривают создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вакцины обоих типов основаны на генноинженерном подходе.

Среди наиболее активно разрабатываемых генно-инженерных продуктов находятся препараты группы цитокинов - интерлейкины, а также вещества родственной группы - антагонисты рецепторов интерлейкинов. Эти препараты перспективны для лечения опухолевых, воспалительных, аутоиммунных заболеваний, а также тяжелых форм болезней крови.

В 2008 году в стадии клинических испытаний и на этапе регистрации находилось 633 биотехнологических препарата для лечения более 100 заболеваний. Основные направления, по которым в данное время ведутся исследования, это - разработка препаратов для лечения тяжелых форм рака, ВИЧ, аутоиммунных заболеваний, болезни Альцгеймера, сердечно-сосудистых заболеваний.

Для создания биотехнологического лекарственного средства в среднем требуется от 10 до 15 лет и примерно около 1.3 млрд. $ (включая стоимость неудач) для того, чтобы запустить новый продукт. Это достаточно долгий и трудоемкий процесс, включающий в себя несколько стадий, но позднее это окупается достаточно низкой себестоимостью по сравнению с рыночной ценой.

Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пептидных гормонов.

Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации - энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека. Таким образом, генная инженерия, будучи одним из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

В настоящее время фармацевтическая промышленность завоевала лидирующие позиции в мире, что нашло отражение не только в объёмах промышленного производства, но и в финансовых средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта, добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии, и именно в этих областях интерес к геномным и генно-инженерным исследованиям исключительно высок.

Таким образом, сущность генной инженерии заключается в том, что, понимая признаки и свойства организма, определяемые тем или иным геном, их можно изменять, удалять или добавлять новые свойства и признаки через изменение, добавление или удаление отдельных генов. Организм, в который были привнесены какие-либо изменения методом генной инженерии называется генетически модифицированным (ГМО) и обладает функциями и свойствами, которые не были характерны ему ранее.

Одним из основных направлений, в котором применяются технологии генной инженерии, является сельское хозяйство. Классическим уже методом улучшения качества продуктов сельского хозяйства является селекция – процесс, в котором путем искусственного отбора выделяются и скрещиваются отдельные растения или животные, обладающие определенными свойствами, для наследственной передачи этих свойств и их усиления. Этот процесс достаточно продолжительный и не всегда действительно результативный. Генная инженерия обладает способностью наделить какой-то живой организм свойствами, ему нехарактерными, усилить проявление каких-то существующих свойств или исключить их. Это происходит за счет внедрения новых или исключения старых генов из ДНК организма.

К примеру, таким образом был выведен особый сорт картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Для этого в геном картофеля был введен ген почвенной тюрингской бациллы Bacillus thuringiensis, которая вырабатывает особый белок, губительный для колорадского жука, но безвредный для человека. Применение генной инженерии для изменения свойств растений, как правило, делается как раз для повышения их устойчивости перед вредителями, неблагоприятными условиями среды, улучшения их вкусовых и ростовых качеств. Вмешательство в геном животных используется для ускорения их роста и повышения продуктивности. В продуктах сельского хозяйства таким образом также искусственно повышается количество незаменимых аминокислот и витаминов, а также их питательная ценность.

Существует мнение, что в контексте постоянного роста населения планеты, только генетически модифицированные продукты смогут в будущем спасти мир от голода, позволяя на ограниченной территории выращивать продукты высокого качества, с повышенным содержанием витаминов и т.д. Однако существует и обратное мнение, выступающее за то, что генно-модифицированные продукты могут быть небезопасными для здоровья человека. Для выяснения вопросов безопасности таких продуктов созданы специальные международные комиссии, которые в настоящее время сходятся во мнении, что генетически модифицированные продукты не представляют опасности для здоровья человека. В подавляющем большинстве стран мира использование генетически модифицированных продуктов разрешено или не урегулировано законодательно.

Количество аргументов за использование ГМП значительно превосходит возможные аргументы против. Так, сторонники ГМП ссылаются в частности на высокий уровень контроля качества всех генетически модифицированных продуктов (ГМП). За двадцатилетнюю историю использования этих продуктов в разных странах мира не было выявлено ни одного факта их отрицательного воздействия на здоровье человека, что нельзя сказать о продуктах традиционного сельского хозяйства, в котором неизбежно применение разного рода удобрений, многие из которых признаны вредными для человека. Более того, селекция, которая используется в сельском хозяйстве на протяжении веков, по сути, преследует целью ту же генную модификацию организмов, только осуществляет это за значительно больший период времени. Генная инженерия просто способна привнести необходимые изменения в организм за короткий срок, а потому использование ГМП не опаснее, чем использование любых других продуктов, выведенных методом классической селекции.

Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенную яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Сегодня фармацевтическая биотехнологическая продукция представлена классическими продуктами: антибиотиками различного назначения (для лечения заболеваний человека и животных, а также для кормовых добавок и премиксов), витаминами, вакцинами и ферментами, а также продуктами «новой биотехнологии», которыми являются генно-инженерные лекарственные препараты, вакцины и диагностикумы нового поколения.

Биомедицинские технологии гораздо полнее отвечают актуальным принципам медицинской помощи:

- предупреждение развития заболеваний;

- восстановление и сохранение здоровья человека;

- адаптация организма человека к изменяющимся условиям внешней среды.

Инновационные биомедицинские технологии будут эффективнее, чем методы и средства, которые мы имеем в своем распоряжении сегодня, однако они должны стать доступными для подавляющего большинства

Стремительный рост численности населения на планете оставляет за биотехнологиями будущее в обеспечении населения продукцией и медикаментами. Для поддержания и развития отечественной биотехнологической инфраструктуры необходимо разработать механизмы государственной поддержки инновационной деятельности в области биотехнологии. В том числе меры по привлечению в сферу биотехнологии частных инвестиций, включая механизмы частно-государственного партнерства, в целях создания биотехнологических производств для выпуска импортозамещающей продукции. Кроме того, необходимо формирование сети технопарков и технико-внедренческих зон в сфере биотехнологии. А также - разработка системы подготовки высоко квалифицированных кадров для развивающейся отрасли.

Библиография

1. Воробьева Л.И. – Промышленная микробиология. – М.: МГУ, 1989. – 294 с.

2. Глик Б., Пастернак Дж. – Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М., Мир. – 2002. – 585 с.

3. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - пер. с англ. Петровой Т.А., Позмоговой И.Н.; Ред. Работнова И.Л. - М.: Мир, 1978. - 330 с.

4. Сассон А. - Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987. – 411 с.

5. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М., Мир. - 1981. - 628 с.

6. Щелкунов  С.Н. – Генетическая инженерия. Новосибирск, издательство Сибирского Университета, 2004. – 496 с.

7. Электронный ресурс: http://www.biotechnolog.ru/.

8. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/Под ред. А.Б. Масленникова. – Вып. 3. – Новосибирск: Альфа Виста, 2003. – 188 с.

9. Снегин Э.А. Введение в генотоксикологию: курс лекций (в помощь студенту)/Э.А. Снегин, Белгородский государственный университет, Научно-исследовательская популяционной генетики и генотоксикологии. – Белгород: ЛитКараВан, 2009. – 176 с.

10. Семченко В.В., Ерениев С.И., Степанов С.С., Дыгай А.М., Ощепков В.Г., Лебедев И.Н. Регенеративная биология и медицина. Кн. 1. Генные технологии и клонирование/ Под ред. В.П. Пузырёва, К.Н. Ярыгина, В.Н.Ярыгина, В.В. Семченко. – Омск-Москва-Томск: Омская обл. типография, 2013 – 296 с.

ЛЕКЦИЯ 7