Материалы и методы

В настоящее время в НИКТИ БАВ разработана технология получения лекарственных препаратов на основе нуклеиновых кислот путём ферментативного гидролиза дрожжей типа Sacchаromyces cerevisiae [10, 11]. Отходы данного производства представляют собой частично гидролизованную биомассу дрожжей в виде пасты с извлеченными нуклеиновыми кислотами (денуклеотизированный дрожжевой продукт - ДНДП) [12]. Для исследования было приготовлено 5 партий ДНДП.

Физико-химические показатели пасты

Содержание массовой доли влаги в ДНДП определяли согласно методике [13]. Содержание сахара определяли по реакции с антроновым красителем [14]. Содержание золы определяли методом высокотемпературного озоления [15]. Белок анализировали по методу Лоури [16]. Содержание нуклеотидного материала определяли методом щелочного гидролиза [17]. Содержание сахаров, белка и РНК в образцах высчитывали от веса сухого препарата.

Дополнительный зоотехнический анализ ДНДП проводили общепринятыми методами [18]. Оценивали массовые доли: сырого протеина, сырой золы, сырого жира и сырой клетчатки.

Аминокислотный состав ДНДП определяли на аминокислотном анализаторе ААА-881 (ЧССР).

Биологические показатели ДНДП

Микробиологические показатели (общую обсемененность и наличие условно патогенной микрофлоры) оценивали стандартными методами [19].

Лабораторные животные (мыши)

Переносимость денуклеотизированного дрожжевого продукта лабораторными животными изучали на белых беспородных мышах. В опыт было отобрано 40 животных (по 20 особей в опытной и контрольной группах). Перед началом эксперимента, в процессе кормления и во время восстановления (без кормовой добавки) фиксировали массу животных. Прирост массы животных опытной группы рассчитывали по отношению к контрольной (в %). Показатели резистентности оценивали по фагоцитозу макрофагов [20] у белых беспородных мышей, получавших ДНДП в течение 5 дней в дозе 1 г/кг.

Сельскохозяйственные животные

Поросята. Эксперимент по применению данного препарата на поросятах был проведён на свиноферме в учебно-опытном хозяйстве НГАУ ”Тулинское“ (г. Новосибирск). Для изучения эффективности применения ДНДП в кормлении поросят-сосунов породы СМ-1 был поставлен опыт, по принципу аналогов были сформированы 2 группы поросят (контрольная и опытная) по 50 голов в каждой. Контрольные животные с 7-10 - дневного возраста получали хозяйственную подкормку - основной рацион, который соответствовал всем нормам кормления, разработанным во Всероссийском институте животноводства (ВИЖ). Поросята опытной группы дополнительно к основному рациону с 7 -дневного возраста получали ДНДП из расчета 0,3 г на 1 кг живой массы в сутки. Перед скармливанием добавка ДНДП, размороженная до однородной жидкой массы, перемешивалась с основным кормом. Добавка скармливалась поросятам до момента их отъема в 60-дневном возрасте.

При проведении эксперимента учитывались следующие показатели: живая масса поросят в начале и в конце опыта; живая масса поросят в 21-дневном возрасте; абсолютный прирост живой массы; среднесуточный прирост живой массы; валовый прирост живой массы; затраты корма на производство 1 кг прироста живой массы поросят.

С целью изучения иммуномодулирующих свойств ДНДП у поросят 2- месячного возраста осуществляли забор крови для сравнительной оценки иммунного статуса животных. При этом определяли гематологические показатели по общепринятым методикам [20]: содержание иммуноглобулинов (IgG) - методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини, общее количество Т-лимфоцитов - в реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана (ТЕ-РОК), количество В-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами мыши (ЕМ-РОК).

Птица. Предварительные опыты по применению ДНДП, проведенные на цыплятах, показали трудности введения пастообразной массы в рацион птицы. Попытки высушить биомассу ДНДП при температуре 100-150^оС приводили к большой спекаемости образцов и необходимости их дальнейшего размола. Это обстоятельство затрудняет технологию приготовления и удорожает конечный продукт.

Добавление к биомассе ДНДП природных цеолитов в соотношении 1 : (0,5-1,5) позволяет приготовить конечный продукт с хорошей рассыпаемостью и потому удобный для применения в птицеводстве, обозначенный как биостимулирующая кормовая добавка (БСКД). Кроме того, благодаря своим физико-химическим свойствам цеолиты стабилизируют кишечную физиологию, нормализуют внутреннюю среду, что приводит к улучшению конверсии кормов. Конечный продукт БСКД получают при температуре 705 ^оС в виде порошка и гранул.

Опыты по оценке влияния на стимуляцию продуктивности и резистентности птицы при внесении в основной рацион ДНДП, БСКД, бифидобактерина проведены на цыплятах-бройлерах. С целью определения влияния на цыплят-бройлеров сформировали 4 группы, которым ежедневно в течение 52 дней скармливали основной рацион (контрольная группа), основной рацион + 3% от этого рациона ДНДП (1 опытная группа), основной рацион + 3% от этого рациона БСКД (2 опытная группа) и основной рацион + бифидобактерин (в соответствии с наставлением по применению) - группа сравнения. Численность каждой из групп составляла 108 голов.

Физико-химические показатели денуклеотизированных дрожжей

Показатели, характеризующие состав ДНДП, представлены в табл. 1.

Физико-химический и биологический анализ 5-ти партий ДНДП показал, что полученный продукт содержит в среднем 2, 78 % белка, 18,8 % сахаров, липополисахаридов – 9,8 % и лишь 0,676 % нуклеиновых кислот (РНК), что в 10-15 ниже, чем в исходной биомассе дрожжей. Содержание компонентов ДНДП высчитывается от веса сухого препарата. ДНДП представляет собой пасту с водородным показателем рН 6,64, массовой долей влаги 76,36 % и 9,42 % золы (охарактеризованной после озоления пасты и имеющей в составе минеральные вещества). Проведенный анализ полученных результатов показал, что оценка белков по методу Лоури не позволяет полностью определить их количество в ДНДП, так как часть этих протеинов находится в связанном состоянии, поэтому дополнительно использовали для оценки суммарных белков метод Кьельдаля.

Повторная работа по определению и расширению данных по химическому составу ДНДП показала, что в сухом веществе продукта содержится: протеина (определен по методу Кьельдаля) - от 20,41% до 25,5%; жира (определен методом экстракции в органическом растворителе) - от 6,8% до 8,1%; золы (определен методом сухого озоления) - от 47,9% до 55,2%; клетчатки- от 14,1% до 26,5% (метод Геннеберга и Штомана в модификации).

Был определен также аминокислотный состав ДНДП. Содержание аминокислот в 5-ти партиях ДНДП приведено в Табл. 2. Из Табл. 2 видно, что в составе белков ДНДП содержатся довольно большие количества незаменимых аминокислот. Суммарное количество аминокислот (в %) совпадает с содержанием белков в ДНДП, определенных по методу Кьельдаля. Следовательно, ДНДП может использоваться как ценная кормовая добавка, поскольку имеет значительные количества белков и липидов, которые являются основными поставщиками энергии.

Указанные выше 5 партий ДНДП были проверены по микробиологическим показателям. Показано, что условно-патогенная микрофлора (сальмонеллы, золотистый стафилоккок, кишечная палочка, клостридии) в образцах отсутствуют. Общая обсемененность ДНДП значительно ниже допустимой нормы (не более 500 тыс. микробных тел в 1 г) и остается в этих пределах (3 ^. 10² микробных тел в 1 г) в течение 6 месяцев.

Биологические показатели ДНДП на лабораторных животных

Результаты изучения переносимости денуклеотизированного дрожжевого продукта на лабораторных животных (белых беспородных мышах) приведены в табл. 3. Использование ДНДП в качестве кормовой добавки в ежедневном рационе беспородных мышей при длительном 12-дневном скармливании в количестве 1 г на голову показало её хорошую переносимость и более быстрый рост массы тела опытных животных по сравнению с контрольными, получавшими обычный корм. Кроме того, отмечена высокая пищевая привлекательность ДНДП.

Влияние кормовой добавки на показатели резистентности оценивали по фагоцитозу макрофагов белых беспородных мышей, получавших ДНДП в течение 5 дней в дозе 1 г/кг (табл.4).

Опыт показал, что введение в рацион мышей ДНДП стимулирует фагоцитарную активность (ФА) перитонеальных макрофагов на 69-85% в опытных группах по сравнению с показателями мышей контрольной группы, получавшими физиологический раствор. Фагоцитарный индекс (ФИ) изменялся незначительно. Известно, что гликаны клеточных стенок дрожжей, согласно сообщениям Лазарева Д. Н., Алёхиной Е. К. [21], обладают свойствами иммуномодуляторов. Корреляция высокого содержания сахаров в ДНДП (табл. 1) с повышенной фагоцитарной активностью мышей, принимавших ДНДП, подтверждает это. В последнее время препаратам на основе клеточных стенок дрожжей (маннановые олигосахариды - МОС) придается большое значение. Маннановые олигосахариды (МОС) являются многообещающей альтернативой антибиотикам. В настоящее время в США разработаны коммерческие препараты Био-МОС (Bio-Mos, Alltech, Inc), которые содержит мананновые олигосахариды. МОС– это сложные неперевариваемые углеводы, экстрагированные из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Биологические показатели ДНДП на сельскохозяйственных животных (поросята)

В результате проведённого эксперимента было установлено, что скармливание поросятам денуклеотизированных дрожжей ДНДП способствовало увеличению прироста их живой массы (Табл.5). На основании данных Табл. 5 можно сделать вывод, что поросята, получавшие добавку, имели прирост живой массы в 21-дневном возрасте выше на 8,7 % и в 60-дневном возрасте - на 8,25 %, чем контрольные животные. При постановке на опыт живая масса поросят контрольной и опытной групп была одинаковой. Показатели абсолютного прироста живой массы поросят свидетельствуют об увеличении скорости роста опытных поросят, по сравнению с контролем, в первый период на 10,34 %, во второй период на 8,04 %.

Введение денуклеотизированных дрожжей в рацион поросятам опытной группы способствовало увеличению их среднесуточного прироста, снижению затрат корма на прирост живой массы (Табл. 6, 7). Из данных Табл. 6 следует, что по сравнению с контрольной группой, среднесуточный прирост опытных поросят увеличился на 8,87 %, что способствовало получению в конце опыта более высокого валового прироста в опытной группе, а это в свою очередь позволило уменьшить затраты корма на килограмм прироста живой массы на 8,2 % (Табл. 7).

В результате гематологического и иммунологического скрининга установлено, что поросята опытной группы имеют статистически достоверное превосходство над контрольными животными по количеству лейкоцитов на 10 % и по концентрации иммуноглобулина (IgG) на 36 %. Кроме того, опытная группа по сравнению с контрольной имеет несколько лучшие показатели ТЕ-РОК, ЕМ-РОК, моноцитов и гемоглобина. Разница, соответственно, составляет 9 %, 18,6 %, 34 % и 6,7 % (Табл. 8).

Анализируя полученные данные, можно сделать заключение, что для повышения прироста живой массы поросят, снижения затрат кормов на производство продукции и усиления клеточного и гуморального иммунитета к отъёму эффективно вводить в рационы поросят-сосунов с 7-дневного возраста до момента отъёма в 60-дневном возрасте денуклеотизированные дрожжи (ДНДП) из расчёта 0,3 г на голову в сутки. Это позволяет увеличить среднесуточный прирост поросят на 8,87 %, снизить затраты корма на килограмм прироста живой массы на 8,2 % и вывести на более высокие уровни ряд показателей иммунного статуса свиней, определяющих резистентность животных.

Положительное действие маннано-глюкановых олигосахаридов при выращивании поросят было получено также в опытах бельгийского исследователя N. Vander Beke [22]. В проведенных опытах использовался контрольный корм, корм с включением МОС (2 кг/т), и корм с добавкой МОС и Lactobacillus. Экспериментальный корм использовался с 14 дня после отъема поросят до достижения 16 кг веса. Маннано-глюкановые олигосахариды улучшили привесы поросят на 7,3% и эффективность использования корма на 5,6%. Добавки кормовых микроорганизмов (Lactobacillus) вместе с МОС еще больше улучшили продуктивность выращивания поросят. Положительное влияние указанных кормовых добавок, как считают авторы данного исследования, могло быть связано со снижением смертности и диареи животных.

Биологические показатели ДНДП и БСКД на птицах

Использование БСКД в качестве кормовой добавки в ежедневном рационе цыплят-бройлеров в течение 52 дней в количестве 3 % от основного рациона показало, что живая масса цыплят к концу опыта увеличилась на 6,6 % по сравнению с контролем, а сохранность птицы возросла на 10,2 % (Табл. 9). Для сравнения: введение в рацион цыплят пастообразного ДНДП дало прирост живой массы лишь на 2,6 %, а сохранности - на 1,9 %; при использовании бифидобактерина эти показатели составили 1,5 % и 3,7 % соответственно.

Современные тенденции в мире в области производства кормов для сельскохозяйственных животных и птиц направлены на ограничение и полный запрет использования кормовых антибиотиков. Причина этого лежит в предположении о том, что использование антибиотиков приводит к появлению лекарственно устойчивых форм бактерий, которые передадут эту устойчивость патогенам человека. Если это случится, то антибиотики, эффективные в настоящее время при лечении заболеваний, станут абсолютно бесполезными [22].

Ситуация, сложившаяся в отношении антибиотиков, подталкивает производителей кормовых добавок, животноводческой и птицеводческой продукции к поиску новых форм препаратов и альтернатив антибиотикам, удовлетворяющих современным требованиям сельскохозяйственного производства.

В качестве таких альтернатив могут рассматриваться маннановые олигосахариды (МОС), пробиотики, биологически активные вещества и иммуномодуляторы на основе РНК, являющиеся продуктами микробиологического синтеза, повышающие иммунологическую реактивность организма [22,23].

Маннановые олигосахариды (МОС) являются многообещающей альтернативой антибиотикам. В настоящее время в США разработаны коммерческие препараты Био-МОС (Bio-Mos, Alltech, Inc), которые содержит мананновые олигосахариды. МОС– это сложные неперевариваемые углеводы, экстрагированные из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Они повышают продуктивность и здоровье птицы, свиней и телят, главным образом, путем улучшения физиологического состояния кишечника и активации физиологических механизмов защиты. Совмещенные с сорбентами (препарат Микосорб - Bio-Mos, Alltech, Inc) они позволяют также эффективно ингибировать микотоксины.