Коллоидная химия В.Н. Сергеев

эффективная концентрация становится больше растворимости и белок осаждается из раствора в виде хлопьев, волокон или рыхлых осадков. Этот процесс, хотя он и называется часто в медицинской литературе коагуляцией белков, только внешне напоминает коагуляцию коллоидных систем (табл 10.1).

Таблица 10.1. Различия между высаливанием белков и коагуляцией золей

не подчиняется правилу Шульце—Гарди подчиняется правилу Шульце—Гарди

При высаливании белков основную роль играют анионы, которые имеют боль - шую способность к связыванию "свободной" воды и по своему высаливающему действию могут быть расположены в прямой лиотропный ряд Гофмейстера :

C2O42– > SO42– > PO43– > CH3COO– > Cl– > NO3– > Br– > I– > CNS–.

Высаливающим действием по отношению к белкам обладают также некоторые органические растворители, в которых белки растворимы хуже, чем в воде, например, спирт или ацетон.

Полнота высаливания зависит от молекулярной массы белков: чем больше молекулярная масса, тем меньше их растворимость и тем полнее и быстрее происходит осаждение. На этой зависимости основан метод фракционированного высаливания. Сущность его состоит в последовательном осаждении отдельных фракций белковой смеси возрастающими порциями электролита или спирта.

На высаливание влияет температура: при понижении температуры раствори - мость белков уменьшается и они осаждаются быстрее. На сочетании действия спирта, солей и охлаждения основан метод детального фракционирования по Кону. Этим методом из сыворотки крови было выделено 12 белков.

Высаливание лучше всего происходит при значениях pH растворов, близких к pI белков, так как в изоэлектрическом состоянии макромолекулы плотно свернуты, имеют минимальные гидратные оболочки и наименьшую растворимость.

2

Рис. 10.1. Кривые, характеризующие зависимость растворимости и высаливания от pH среды и иллюстрирующие метод определения ИЭТ белков по растворимости

111

При высаливании не происходит изменения нативной (природной) структуры биополимеров, поэтому данный метод осаждения белков обратим и нашел широкое применение для выделения и очистки белков.

Комплексная коацервация. Это явление наблюдается при смешивании растворов полиэлектролитов, имеющих противоположные заряды макромолекул (например, двух белков с различными pI или белков и нуклеиновых кислот) или резко отличающихся по гидрофильности (например, желатина и крахмала или белков и лецитина). По существу, комплексная ко ацервация — это нарушение устойчивости раствора одного биополимера под действием другого.

При комплексной коацервации возможны следующие наиболее типичные случаи:

белок А намного гидрофильнее белка Б, тогда белок Б высаливается и выпадает в виде хлопьев;

белок А гидрофильнее белка Б, но не в такой степени, как в предыдущем случае, в итоге происходит коацервация белка Б, образующего вязкий коацерват.

Коацервация, особенно комплексная, играет огромную роль в биологических процессах, происходящих в клеточном веществе — цитоплазме. По некоторым своим свойствам коацерваты похожи на цитоплазму. Комплексная коацервация может сопровождать образование нуклеопротеинов, липопротеинов и других сложных белков. Согласно одной из теорий происхождения жизни на Земле (А. И. Опарин) именно коацерваты являются зародышами клеток и древних форм жизни.

Денатурация. Это нарушение нативной пространственной структуры белка (четвертичной, третичной и вторичной структур), приводящее к изменению его физико-химических и биологических свойств.

Врезультате денатурации изменя ются форма и размеры макромолекул, увеличивается вязкость растворов, уменьшаются растворимость и степень набухания, уменьшается или исчезает биологическая активность, белки теряют

гидрофильность, становятся гидрофобными и выпадают в осадок, при этом, если денатурирующие агенты окрашены (таннины, сульфат меди), то образующиеся осадки тоже имеют окраску.

В ряду нарушений устойчивости растворов белков денатурация занимает особое положение. Она не является следствием силь ных межмолекулярных взаимодействий или замедленности процессов ассоциации в растворах ВМС. Главные отличия денатурации от высаливания и коацервации заключаются в глубоких нарушениях нативной структуры белков в результате очень "грубых" воздействий на них денатурирующих факторов и в необратимости этого процесса. Денатурация является следствием разрыва нековалентных связей, фиксирующих нативную структуру макромолекулы, а также разрыва или образования дисульфидных связей между различными участками молекулы белка. Факторы, вызывающие денатурацию, суммированы в табл. 10.2.

112

Таблица 10.2. Факторы, вызывающие денатурацию

Проникающая радиация (вызывает Органические растворители в больших разрушение водородных связей, количествах (обезвоживание белковых

образование свободных радикалов, молекул).

окисление дисульфидных мостиков). Гуанидин, мочевина (конкуренция за

водородные связи в молекулах белка).

Окислители и восстановители (вызывают разрушение и образование дисульфидных мостиков в третичной структуре белка).

Вотличие от высаливания денатурацию нельзя применять для выделения белков, так как при "мягкой" или обратимой денатурации, которую

вызывают некоторые соли или органические реагенты, обратимость денатурации наблюдается очень редко, чаще же всего белок после прекращения действия даже мягкого денатурирующего агента не полностью идентичен по своим свойствам нативному. Возможность провести обратимую денатурацию, т. е. вновь после денатурации получить белок с исходной структурой и биологическими свойствами, впервые была показана на ферменте рибонуклеазе. Если путем восстановления четырех дисульфидных связей этого белка избытком 2-меркаптоэтанола в растворе мочевины развернуть его молекулу, а после удаления денатурирующих агентов провести контролируемое окисление, то белок приобретает нативную структуру и почти полностью восстанавливает ферментативную активность.

Денатурация белков имеет большое значение для физиологии и медицинской практики. В первую очередь это — кулинарная и технологическая обработка пищевых белков, применение вяжущих, дубящих и дезинфицирующих средств, лечение отравлений тяжелыми металлами, когда больному назначают сырой куриный белок, который сам легко денатурируется вследствие содержания большого числа групп — SH, защищая тем самым белки организма. Она играет большую роль в процессе пищеварения и во взаимных превращениях активных и неактивных форм некоторых ферментов и гормонов. В недавно проведенных исследованиях механизма старения организма было показано, что одной из причин этого процесса является медленная денатурация белков организма, наступающая в результате изменения химического состава растворов белков, обусловленно - го сложными биологическими процессами — процессами обмена веществ.

113

10.2. В а ри а н ты во п ро с о в и з а д а ч д л я с а м о с то яте л ьн о й ра б о ты Вариант 1

1.Какие типы межмолекулярных взаимодействий проявляются в растворах белков?

2.Ниже описаны явления, протекающие в растворах белков при действии различных факторов. Назовите эти явления, используя приведенные ответы: 1) К сыворотке крови последовательно добавляли возрастающие количества

сульфата аммония, при этом в осадок выпали 3 белковые фракции: эйглобулины, псевдоглобулины и альбумины.

2)Белковый фермент пепсин, инактивированный в растворе нагреванием или действием щелочи вновь приобретает исходную активность после стояния или возврата к прежнему значению pH.

3)При добавлении к раствору желатина раствора крахмала наблюдается выделение капель другой жидкой фазы, а через некоторое время происходит

разделение системы на два слоя с четкой границей между ними. 4) После добавления к раствору яичного белка в воде некоторого колич ества раствора сульфата меди (II) выпал нерастворимый осадок бледно-голубого цвета.

(M 68000, pI 4.7) и глобулинов (M 160000, pI 6.4), входящих в состав яичного белка, можно использовать хлорид натрия. На чем основано это разделение? Какими методами можно еще разделить данные белки, используя другие электролиты или способ Кона?

4.Каково биологическое значение денатурации? Можно ли использовать денатурацию при выделении белков для медицинских целей?

5.На чем основано применение сырого яичного белка для оказания первой помощи при лечении отравлений солями тяжелых металлов?

Вариант 2

1.В чем заключается основное отличие процессов, протекающих в растворах белков, от процессов в растворах низкомолекулярных соединений?

2.Ниже описаны явления, происходящие в растворах белков под действием различных факторов. Назовите эти явления, используя приведенные ответы: 1) Действием 20%-го (полунасыщенного) раствора сульфата аммония из

сыворотки крови в осадок выделен -глобулин. После удаления соли с помощью диализа или молекулярно -ситовой хроматографии осадок снова переведен в раствор.

2)При добавлении небольшого количества 2-меркаптоэтанола-1

(HSCH2CH2OH) к раствору белка рибонуклеазы произошла частичная потеря ферментативной активности этого белка, но после стояния и воздействия кислорода каталитические свойства фермента восстановились.

3)При добавлении к раствору желатина небольшого количества изопропилового спирта в объеме раствора образовались капли, обогащенные белком, после слияния которых произошло разделение системы на два жидких слоя с четкой границей между ними.

4)После добавления к раствору яичного белка в воде некоторого количества раствора трихлоруксусной кислоты образовался нерастворимый в воде белый осадок.

114

(pI = 4.7). Предложите схему разделения этих белков высаливанием, исполь - зуя их кислотно-основные свойства. В Вашем распоряжении есть растворы кислот (или оснований) и одна из высаливающих солей, например, NaCl.

4.Какой из указанных факторов при действии на растворы белков способствует высаливанию, а какой вызывает денатурацию: а) добавление большого

Как уже отмечалось раньше, растворы ВМС обладают рядом свойств, аналогичных свойствам золей, поэтому удобно рассматривать некоторые процессы, протекающие в этих системах, не по отдельности, а в совокупности. К таким процессам относится образование гелей в золях и студней в растворах ВМС. По этой же причине далее будут совместно рассмотрены вязкостные, молекулярно -кинетичес- кие, коллигативные и электрокинетические свойства золей и растворов ВМС.

Коллоидные системы и растворы ВМС при некоторых условиях способны образовывать пространственные структуры: гели и студни. Гели и студни являются связнодисперсными системами.

Гели — коллоидные системы, потерявшие текучесть в результате образова - ния внутренних структур. Они обычно эластичны, но могут быть хрупкими.

Гелеобразование — процесс превращения золей в гели.

Студни — растворы ВМС, потерявшие текучесть в результате образования в них внутренних структур, эластичны.

Застудневание — процесс превращения растворов ВМС в студни.

11.1. О с н о в н ы е з а к о н о м е р н о с т и г е л е о б р а з о в а н и я

Образование гелей, как и коагуляция, происходит в результате снижения агрегативной устойчивости коллоидных систем. Однако, между гелеобразо - ванием и коагуляцией есть различие. При коагуляции факторы устойчивости полностью перестают действовать, частицы дисперсной фазы теряют агрегативную устойчивость и образуют плотный осадок. При образовании гелей действие факторов устойчивости в частично астабилизованных золях ослабевает только на некоторых участках поверхности частиц: на выступах, ребрах, углах. Частицы контактируют этими участками и образуют пространственную сетку, в ячейках которой находится дисперсионная среда (рис. 11.1).

Рис. 11.1. Образование структур в золях с частицами разной формы

115

В начале процесса гелеобразования в местах контактов частиц остаются прослойки дисперсионной среды, поэтому такие структуры эластичны, их называют коагуляционными структурами (рис. 11.2).

С течением времени коагуляционные структуры превращаются в конденсаци- онно-кристаллизационные (рис. 11.3), в которых частицы соединены либо за счет образования химических связей, либо вследствие сращивания кристалликов, образующихся в процессе выкристаллизовывания новой фазы в местах контактов частиц (так происходит сращивание отломков костей после переломов). В гелях такие структуры образуются при более сильной астабилизации, когда осуществляются полные контакты между частицами и прослойки дисперсионной среды между ними вытесняются (совершенствование контактов). Конденсационно-кристаллизаци- онные структуры более прочные, чем коагуляционные и хрупкие (не эластичные).

На гелеобразование влияют:

концентрация золя — с повышением концентрации возрастает число контактов, приходящихся на единицу объема, увеличивается скорость образования геля;

форма частиц — золи с анизодиаметрическими частицами (длина частиц существенно больше их толщины) быстрее превращаются в гели, чем золи со сферическими частицами, особенно при наличии у частиц выступов, углов и ребер, где двойные электрические слои и сольватные оболочки развиты менее всего;

температура — при небольшом повышении температуры время гелеобразования уменьшается, но при большом повышении температуры увеличивается интенсивность броуновского движения частиц и гели могут переходить в жидкое состояние — плавиться;

механические воздействия, например, перемешивание, обычно препятствуют образованию гелей.

11.2. О с н о в н ы е з а к о н о м е р н о с т и з а с т у д н е в а н и я

Студни образуются в результате взаимодействия макромолекул, приводя - щего к возникновению надмолекулярных структур, предшественниками которых являются ассоциаты. Если средний период существования ассоциатов становится очень большим, то их распад не происходит и временные связи между макромолекулами могут превратиться в постоянные за счет:

сильного взаимодействия полярных групп;

взаимодействия противоположно заряженных ионизированных групп;

образования водородных связей;

гидрофобных взаимодействий;

образования химических связей (например, –S–S–).

Существенно при этом, что связи возникают не по концам макромолекул, как при образовании гелей из золей, а между любыми участками гибких

116

макромолекул, на которых ослаблена или отсутствует гидратная оболочка, это так называемые "оголенные" участки.

Макромолекулы, связываясь между собой на "оголенных" участках, образуют рыхлую пространственную структуру, или общий каркас, в ячейках которого достаточно прочно удерживается весь объем раство рителя (рис. 11.4).

Рис. 11.4. Структура студня, образованного фибриллярным белком

Образование студня обычно достаточно медленный процесс; время застудневания может колебаться от нескольких минут до недель в зависимости от различных факторов.

На застудневание влияют:

концентрация раствора — при повышении концентрации увеличивается частота столкновений макромолекул и число связей, образующихся в единице объема;

температура — повышение температуры препятствует застудневанию из-за возрастания интенсивности микроброуновского движения и уменьшения числа и длительности контактов между молекулами; понижение температуры ускоряет застудневание;

pH среды — застудневание растворов белков лучше всего идет при pH, близких к pI, так как в изоэлектрическом состоянии макромолекулы наименее гидратированы, в них много "оголенных" участков, а расположенные на этих участках противоположно заряженные группы, взаимодействуя с такими же группами других молекул, способствуют установлению межмолекулярных связей;

электролиты — их действие на застудневание противоположно влиянию на набухание: ионы, усиливающие набухание, замедляют застудневание или делают его вообще невозможным; ионы, уменьшающие набухание, способствуют застудневанию (см. раздел 9.3);

форма макромолекул — хорошо застудневают растворы фибриллярных белков, хуже — глобулярных.

11.3. О с о б е н н о с т и г е л е й и с т у д н е й

Гели при высыхании уменьшаются в объеме и становятся хрупкими, затем рассыпаются в порошок.

Студни также уменьшаются в объеме, но сохраняют эластичность. Студни способны к набуханию, гели не набухают.

Гели коагуляционной структуры и студни, в которых не образовались химические ковалентные связи, тиксотропны.

Тиксотропия — способность структурированных систем постепенно самопроизвольно восстанавливаться после их механ ического разрушения.

Конденсационно-кристаллизационные структуры не тиксотропны.

117

Тиксотропия — явление достаточно распространенное. Оно наблюдается в золях V2O5, WO3, Fe2O3, в различных суспензиях бентонитовых глин, в растворах вируса табачной мозаики, белка миозина.

Для структурированных систем характерно так называемое старение. Это проявляется в том, что после образования коагуляционных структурированных систем с течением времени наблюдается уменьшение их объема с сохранением формы, а растворитель или дисперсионная среда выдавливаются из уплотнившегося студня или геля, сначала в виде отдельных капель на их поверхности, которые затем сливаются вместе, образуя сплошную жидкую фазу. Это явление называется синерезисом (рис. 11.5).

Рис. 11.5. Синерезис студня

Синерезис наступает вследствие усовершенствования, постепенного упрочнения и сжатия внутренних структур. В студнях этот процесс сводится к установлению большего числа связей между макромолекулами, а в гелях — за счет увеличения числа контактов между частицами при перегруппировке их. В гелях процесс синерезиса необратим, так как приводит к образованию конденсационно-кристаллизационных структур, у студней, наоборот, синерезис обратим. Иногда достаточно простого нагревания, чтобы студень после синерезиса вер нулся в исходное состояние.

Скорость синерезиса увеличивается при незначительном повышении температуры и концентрации. У белковых студней синерезис ускоряется при pH = pI и при добавлении электролитов, способствующих застудневанию.

Явление синерезиса в быту и в технологии многих материалов чаще всего нежелательны. Примером этого могут быть черствение хлеба, сыра, отмокание кондитерских изделий и т. д. Для растительных и животных организмов синерезис также является отрицательным фактором (см. раздел 11.5).

11.4. Ф и з и к о - х и м и ч е с к и е с в о й с т в а с т у д н е й и г е л е й

Студни являются гомогенными системами и, несмотря на потерю текучести, сохраняют некоторые свойства обычных жидкостей. Свободная диффузия низкомолекулярных частиц (ионов, молекул) в студнях принципиально не отличается от диффузии в чистом растворителе, но скорость ее несколько ниже и тем меньше, чем больше концентрация студня. То же самое относится к электропроводности студней, содержащих электролиты.

Гели — системы гетерогенные и обычно являются хорошими адсорбентами, так как обладают развитой поверхностью раздела фаз, на которой идут адсорбционные процессы.

Химические реакции в студнях идут медленно и часто не до конца. Нередко наблюдается периодичность отложения осадков, состоящих из продуктов этих реакций.

118

11.5. М е д и к о - б и о л о г и ч е с к о е з н а ч е н и е с т у д н е й , т и к с о т р о п и и и с и н е р е з и с а

Студни очень широко представлены в растительных и животных организмах, они определяют структуру клеток, водообмен и другие свойства организма. Так, в организме человека студнями являются цитоплазма клеток, водянистое содержимое глазного яблока, вещество мозга.

Мышцы включают студни, содержащие фибриллярный белок миозин. Студни миозина обладают сильно выраженными тиксотропными свойствами. Под влиянием нервных импульсов и вследствие эластичности эти своеобразные студни способны сокращаться, совершать работу и обеспечивать двигательные процессы организма. Протоплазма клеток также тиксотропна. Легкий переход цитоплазмы из студня в раствор и обратно (переход цитоскелет раствор) лежит в основе функционального состояния клеток.

Синерезис белковых студней приводит к уплотнению тканей, что отрицательно сказывается на проницаемости, например, клеточных мембран и цитоплазмы и ведет к нарушению обмена веществ между клеткой и окружающей средой, в результате чего изменяется химический состав среды и усиливается медленная денатурация белковых систем организма.

11.6. В а ри а н ты во п ро с о в и з а д а ч д л я с а м о с то яте л ьн о й ра б о ты Вариант 1

1.Золь V2O5 через определенное время после его получения потерял текучесть. Какое явление может быть причиной этого?

2.В каком из двух золей оксида железа (III): 2%-м или 3%-м раньше начнется процесс гелеобразования? Ответ поясните.

3.Имеются три золя с одинаковой массовой долей дисперсной фазы. В первом золе частицы имеют форму тонких палочек, во втором частицы листочкообразные и в третьем — сферические. Какой из этих золей при одинаковых условиях быстрее превратится в гель?

4.Как влияет температура на процесс гелеобразования? Что может произойти с образующимся гелем при значительном повышении температуры?

5.Суспензия бентонитовой глины с массовой долей дисперсной фазы 10% представляет собой пластическое твердообразное тело, не обладающее текучестью, но после встряхивания разжижается и легко вытекает из сосуда. Через некоторое время суспензия снова становится твердообразной. Как называется описанное явление?

6.Если структурированная система обладает способностью к тиксотропии, то какая в ней образовалась структура: конденсационно-кристаллизационная или коагуляционная?

7.На экзамене по химии студент дал следующее определение синерезиса: "Это, когда при старении гель плачет". Как Вы считаете, принял экзаменатор этот ответ?

8.Какова биологическая роль синерезиса в животных организмах?

119

Вариант 2

1.При охлаждении 0.1%-го раствора агар-агара от 45 C до 10 C через некоторое время наблюдается увеличение вязкости раствора и потеря текучести. О каком явлении идет речь?

2.В каком из двух растворов яичного белка: 5%-м или 8%-м раньше начнется процесс застудневания? Ответ поясните.

3.2%-й раствор желатина превращается в студень при комнатной температуре, а 0.5%-й при этой же температуре студня не образует. Как можно и этот раствор желатина превратить в студень?

4.Объясните, почему в средах с pH, близкими к pI белков,структурирование растворов белков при прочих равных условиях происходит быстрее?

5.Как можно объяснить тот факт, что 5% -й раствор желатина застудневает

при добавлении K2SO4 через 25 мин, при добавлении KI — через 200 мин, а при добавлении KCNS образование студня не происходит?

6.При нагревании сгустка крови до 35 – 40 C наблюдается выделение из него слегка окрашенной почти прозрачной сыворотки. Назовите это явление.

7.Какова биологическая роль тиксотропии белковых систем организма?

8.Какие явления лежат в основе старения белковых структур организма?

12. В Я З К О С Т Н Ы Е С В О Й С Т В А З О Л Е Й И Р А С Т В О Р О В В М С

12.1. В я з к о с т ь з о л е й

Вязкость — свойство текучих тел (газов и жидкостей) оказывать сопротивление необратимому перемещению одной их части относительно другой. Иными словами, величина вязкости ( ) характеризует интенсивность сил трения между слоями движущейся жидкости.

Ламинарное (слоистое) течение* жидкостей описывается законами Ньютона и Пуазейля. По закону Ньютона сила внутреннего трения (F) прямо пропорциональна коэффициенту внутреннего трения или вязкости ( ), которая является постоянной величиной, и не зависит от напряжения сдвига (P) (прилагаемого давления, вызывающего течение жидкости), площади (S) трущихся друг о друга слоев жидкости и скорости их движения (v) и обратно пропорциональна расстоянию между слоями (x) (рис.12.1):

F = dvdx S,

где dv — градиент скорости перемещения слоев жидкости ; — вязкость,

dx

Н с/м2 или Па с.

* Примером ламинарного течения является течение крови в здоровых неповрежденных сосудах.

120