Коллоидная химия В.Н. Сергеев

выделяются при помощи носителей с SH-группами, благодаря образованию дисульфидных связей S–S. Носителями в данном виде хроматографии служ ат силикаты, декстрины, целлюлоза и др.

Разделение веществ выполняется следующим образом: в колонку помещают носитель, к которому ковалентно присоединен афинный лиганд, например, ингибитор, специфический для выделяемого фермента. Через колонку пропускают раствор смеси белков, содержащий выделяемый белок -фермент, который связывается с ингибитором; другие белки проходят колонку, не вступая ни в какие взаимодействия с лигандом. Для снятия оставшегося на колонке выделяемого фермента колонку промывают раствором активного ингибитора этого фермента.

Биоспецифической хроматографией выделяют специфические нуклеиновые кислоты, ферменты, рецепторы лекарственных препаратов, гормоны, вирусы, антитела, антигены, клетки. Этим методом можно выделять следовые (до нескольких мкг) количества биологически активных веществ.

3.3.5. Р а с п ре д е л и те л ьн а я х ро м а то г ра фи я

Распределительная хроматография основана на различии в распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами — подвижной и неподвижной, нанесенной на твердый носитель. Скорость перемещения концентрационных зон разделяемых компонентов определяется их коэффициентами распределения *.

Примером распределительной хроматографии является хроматография на бумаге (бумажная хроматография).

Бумажная распределительная хроматография. Этот вид хроматографии нашел широкое применение для анализа и идентификации микроскопических количеств веществ или их смесей (от 0.001 до 1 мкг).

В бумажной хроматографии носителем неподвижной фазы является хроматографическая бумага, равной плотности и толщины и одинаковая по всем свойствам во всех направлениях. Хроматографическая бумага гигроскопична и содержит обычно до 25% воды, которая и является неподвижной фазой.

При проведении анализа смеси веществ каплю исследуемого раствора (1 – 10 мкл) и капли растворов "свидетелей" — веществ, присутствие которых в смеси предполагается, — наносят на край листа хроматографической бумаги на так называемую линию "старта". Край бумаги ниже стартовой линии опускают в подвижную фазу (органический растворитель или смесь растворителей, менее полярные, чем вода), помещенную в хроматографическую камеру. Под действием капиллярных сил растворитель движется вверх вдоль листа и

* Когда к двухфазной жидкой системе добавляют какое-нибудь вещество, в общем случае оно распределяется между фазами с неодинаковыми равновесными концентрациями вещества в каждой фазе. Отношение концентраций вещества в двух фазах и есть коэффициент распределения.

31

захватывает разделяемые вещества, скорость перемещения которых зависит от коэффициентов распределения их между водой и органическим растворителем. После достаточного продвижения фронта растворителя бумагу вынимают из хроматографической камеры и высушивают. Если разделяемые вещества бесцветные, то хроматограмму проявляют, обрабатывая реактивом, образующим окрашенные соединения с анализируемыми веществами. При анализе состава смеси сопоставляют положение пятен "свидетелей" с положением пятен разделенных веществ и делают вывод о наличии или отсутствии в смеси тех или иных веществ.

Рис. 3.6. Бумажная хроматограмма

Положение пятен веществ на хроматограмме характеризуют фактором удерживания (Rf):

Значение Rf для данного соединения является характеристической величиной. Эти значения для большинства веществ приведены в специальных таблицах и могут применяться для идентификации.

3.4. П р и м е н е н и е х р о м а т о г р а ф и и в м е д и ц и н е

Биоспецифическая хроматография применяется при изучении ферментативной активности, для удаления нежелательных белковых компонентов из крови, лимфы и плазмы при клинической детоксикации, например, при лечении различных иммунологических заболеваний, для чего в кровообращение больного включается колонка со специфическим иммуносорбентом.

В фармакологии и фармации основное направление использования хроматографии — это идентификация лекарственных веществ, определение их чистоты, количества и состава примесей, количественное определение биологически активных компонентов в растительном сырье, в полупродуктах, в

32

сложных лекарственных смесях. Хроматография служит для контроля производства лекарств, для изучения стабильности лекарственных форм, для выбора метода оценки стабильности и т. д.

Наибольшее значение хроматография приобрела в клинической фармаколо - гии и фармакокинетике — для определения минимальных концентраций лекарств в биосредах организма и для исследования путей их метаболизма, что особенно важно в педиатрии и при лечении пожилых больных.

Наконец, исключительно эффективно применение хроматографии при лечении психотропными препаратами, особенно при длительном применении, когда длительный прием их вызывает изменение метаболизма в зависимости от индивидуальных особенностей пациента и требуется дифференциированный подход к больному.

Необходимо отметить, что исторически свое первое применение в медицине хроматография получила в судебной токсикологии, когда в 1955 году в Англии было раскрыто дело об убийстве детей путем введения им барбитуратов. Ни один из до тех пор известных методов определения отравляющих веществ не давал возможности быстрого и точного анализа примененного яда. И только использование бумажной хроматографии позволило решить эту проблему и закончить столетнюю историю поисков методов определения растительных алкалоидов и их синтетических аналогов.

3.5. В а ри а н ты во п ро с о в и з а д а ч д л я с а м о с то яте л ьн о й ра б о ты Вариант 1

1.Укажите на каком доминирующем механизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии:

1) адсорбционная, 2) ионообменная, 3) молекулярно -ситовая; а) различная способность к ионообменной адсорбции,

б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой, в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различные коэффициенты распределения, д) различная способность к физической адсорбции.

2.Предложите наиболее эффективную методику хроматографического разделения веществ для:

а) очистки выделенной из биологической жидкости белковой смеси от примесей низкомолекулярных соединений и неорганических электролитов, применяемых для высаливания белков; б) быстрой идентификации и определения чистоты лекарственных препаратов.

3.Теплота адсорбции (кДж/мо ль) галогенпроизводных углеводородов RHal на различных адсорбентах имеет следующие величины:

33

а) Какой адсорбент необходимо применить для разделения методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хроматографии смеси, состоящей из 1-бромгексана, 1-фторгексана и 1-иодгексана?

б) В каком порядке будут выходить из колонки разделяемые компоненты смеси?

4.Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси: а) гексанол-1, пентанол-2, 2-метилгексанол-2; б) D-глюкозамин, D-глюкуроновая кислота, D-маннаровая кислота? Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ.

5.При анализе смеси липидов методом тонкослойной хроматографии на

6.Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробы в хроматограф до выхода максимума пика на хроматограмме, в мин) спиртов при определении их методом ГЖХ: метанол — 0.45, пропанол — 0.90, этанол — 0.62. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси.

7.На рисунке изображена проявленная тонкослойная хроматограмма лекарственных препаратов ряда пенициллина, выполненная в варианте со "свидетелями". Какие вещества присутствуют в смеси? Какие вещества не идентифицированы и можно ли их идентифицировать с помощью

приведенных ниже значений Rf для аналогичных условий анализа, если l0 = 120 мм, l1 = 85 мм, l2 = 71.5 мм?

Вариант 2

1.Укажите на каком доминирующем ме ханизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии:

34

1) распределительная, 2) биоспецифическая, 3) ионообменная; а) различная растворимость соединений, образующихся при взаимодействии

с осадителем в неподвижной фазе, б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой,

в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различная способность к ионообменной адсорбции, д) различные коэффициенты распределения.

2.Предложите и обоснуйте наиболее эффективную методику хроматографического разделения веществ для:

а) выделения основных аминокислот из гидролизата белка, полученного при исследовании его аминокислотной последовательности; б) выделения антител на специфический антиген при исследовании иммунологического статуса больного.

3.Теплота адсорбции (кДж/моль) карбоновых кислот и их производных на адсорбенте "флорисил" имеет следующие величины:

Определите, в каком порядке будут выходить из колонки разделяемые методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хроматографии компоненты смеси, включающей в себя: амид бутановой кислоты, этиловый эфир гексановой кислоты, бензойную кислоту, нитрил пара-метилбензойной кислоты, пентановую кислоту?

4.При анализе смеси нуклеиновых оснований методом бумажной хроматографии были получены следующие результаты: длина пробега

фронта растворителя l0 = 257 мм, расстояния от середины пятен до линии старта l1 = 77 мм, l2 = 94 мм, l3 = 205 мм, l4 = 184 мм. Пользуясь таблицей Rf, определите, какие вещества обнаружены в смеси.

5.Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси: а) фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин; б) глюкоза, лактоза, сахароза? Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ.

6.Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробы в хроматограф до выхода максимума пика на хроматограмме, в мин) углеводородов при определении их методом ГЖХ: бензол — 1.30, толуол — 3.80, гексан — 1.65. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси.

35

7.На рисунке изображена бумажная хроматограмма, полученная при нарколо - гической экспертизе, выполненная в варианте со "свидетелями". Какие вещества присутствуют в смеси? Какие вещества не идентифицированы и

можно ли их идентифицировать с помощью таблицы Rf для аналогичных условий анализа, если l0 = 125 мм, l1 = 65 мм, l2 = 87 мм?

Вариант 3

1.Укажите на каком доминирующем механизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии:

1) биоспецифическая, 2) адсорбционная, 3) распределительная; а) различная способность к ионообменной адсорбции,

б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой, в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различные коэффициенты распределения, д) различная способность к физической адсорбции.

2.Предложите и обоснуйте наиболее эффективную методику хроматографи - ческого разделения веществ для:

а) выделения нуклеиновых оснований из продуктов гидролиза специфической нуклеиновой кислоты, полученных при изучении ее нуклеотидной последовательности; б) быстрого определения концентрации и типа фосфорорганического инсектицида, явившегося причиной бытового отравления больного.

3.Теплота адсорбции (кДж/моль) спиртов и карбонильных соединений на силикагеле имеет следующие величины:

36

Определите, в каком порядке будут выходить из колонки разделяемые методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хромато - графии компоненты смеси, включающей в себя: бутаналь, пентанол-1, крезол, диэтилкетон, бензальдегид, дифенилкетон?

4. При анализе смеси сахаров методом тонкослойной хроматографии на силикагеле были получены следующие результаты: длина пробега фронта

5.Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси: а) фенол, о-нитрофенол, п-метилфенол; б) ксилит, сорбит, маннит? Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ.

6.Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробы в хромато - граф до выхода максимума пика на хроматограмме, в мин) сложных эфиров при определении их методом ГЖХ: этилацетат — 2.0, метилформиат — 0.55, изо-пропилацетат — 3.65. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси.

7.На рисунке изображена тонкослойная хроматограмма смеси аминокислот, выполненная в варианте со "свидетелями". Какие вещества присутствуют в смеси? Какие вещества не идентифицированы и можно ли их

идентифицировать с помощью таблицы Rf для аналогичных условий анализа, если l0 = 100 мм, l1 = 19 мм, l2 = 37 мм?

4. Д И С П Е Р С Н Ы Е С И С Т Е М Ы

В широком смысле слова дисперсность присуща любому веществу на молекулярном, атомном, ядерном и т. д. уровне. В нашем курсе понятие дисперсности распространяется на широкую область размеров тел: от несколько бóльших, чем простые молекулы, до видимых невооруженным глазом, т. е. от 10–7 до 10–2 см.

37

4.1. К л а с с и ф и к а ц и я д и с п е р с н ы х с и с т е м 4.1.1. По а г ре г а тн о м у с о с то ян и ю фа з

Как и дисперсные системы вообще, коллоидные дисперсные системы состоят, как минимум, из двух фаз — дисперсной фазы и дисперсионной среды. Наиболее общая классификация дисперсных систем основана на различном агрегатном состоянии этих фаз, в соответствии с чем дисперсные системы делят на 8 типов (табл. 4.1). Для краткости их обозначают дробью, числитель которой указывает на агрегатное состояние дисперсной фазы, а знаменатель — дисперсионной среды.

Таблица 4.1. Классификация дисперсных систем по агрегатному состоянию фаз.

Дисперсные системы можно разд елить на свободнодисперсные, в которых частицы дисперсной фазы не связаны между собой (суспензии, эмульсии, золи пены, аэрозоли), и связнодисперсные, в которых частицы дисперсной фазы не могут перемещаться свободно. К связнодисперсным системам относятся ге ли и студни, твердые растворы (сплавы), пористые тела.

4.1.3. По д и с п е рс н о с ти

В зависимости от степени дисперсности частиц дисперсные системы подразделяются на:

грубодисперсные, с размером частиц от 10–3 до 10–2 см и более (грубые суспензии, песок);

микрогетерогенные, с размером частиц от 10–5 до 10–4 см (эмульсии, тонкие суспензии, аэрозоли, порошки);

ультрамикрогетерогенные системы, с размером частиц от 10–7 до 10–6 см

(золи), именно эти системы носят название "коллоидные дисперсные системы".

38

4.1.4. По м е ж фа з н о м у вз а и м о д е й с тви ю

В зависимости от интенсивности взаимодействия дисперсной фазы с дисперсионной средой различают лиофильные и лиофобные системы. Если дисперсионной средой является вода, то соответствующие системы называются гидрофильными и гидрофобными, соответственно. В гидрофильных системах дисперсная фаза хорошо взаимодействует с водой, а в гидрофобных — плохо.

Как следствие, в лиофильных системах поверхностное натяжение на границе раздела фаз невелико; в них мала и поверхностная энергия, что дела ет их термодинамически устойчивыми. В лиофобных системах поверхностное натяжение на межфазной границе большое; они обладают большей поверхностной энергией и являются термодинамически неустойчивыми.

4.2. П о в е р х н о с т н ы е я в л е н и я в к о л л о и д н ы х д и с п е р с н ы х с и с т е м а х

Коллоидные системы обладают огромной суммарной поверхностью раздела фаз. Особое значение для этих систем имеют процессы образования поверхностных слоев на межфазной границе, приводящие к снижению поверхностной энергии или переходу ее в другие виды энергии (например, в электрическую).

Бóльшую часть процессов, происходящих на поверхности раздела фаз в дисперсных системах, можно отнести к процессам адсорбции — это образование двойного электрического слоя, образование пленок из молекул ПАВ или макромолекул высокомолекулярных соединений, а также возникновение адсорбционно-сольватных оболочек.

4.2.1. О б ра з о ва н и е и с тро е н и е д во й н о г о эл е к т ри ч е с к о г о с л о я

Возникновение двойного электрического слоя (ДЭС) на межфазной границе происходит самопроизвольно и связано с переходом ионов из одной фазы в другую. В зависимости от того, переходят ли ионы из раствора на поверхность или с поверхности в раствор, различают два механизма образования ДЭС.

Первый называют адсорбционным, второй — поверхностной диссоциацией.

Адсорбционный механизм. Рассмотрим его на примере избирательной адсорбции ионов на кристалле AgCl, образовавшемся при взаимодействии водных растворов AgNO3 и KCl.

AgNO3 + KCl AgCl + KNO3

Пусть при этом одно из реагирующих веществ (например, KCl) было взято в избытке. Таким образом, образовавшиеся кристаллы AgCl будут находиться в растворе, содержащем ионы K+, Cl– и NO3–.

Чтобы определить, какие из этих ионов будут адсорбироваться на поверхности кристалла AgCl, применим правило избирательной адсорбции, сформулированное Фаянсом и Панетом.

На поверхности адсорбента преимущественно адсорбируются ионы, которые или входят в состав вещества адсорбента, или изоморфны его ионам и способны достраивать кристаллическую решетку вещества, или образуют с одним из ионов вещества труднорастворимые соединения.

39

Изоморфными называют вещества, атомы, ионы или молекулы которых обладают способностью замещать другие атомы, ионы или молекулы в кристаллических структурах.

В рассматриваемом случае адсорбироваться на поверхности кристалла AgCl будут ионы Cl–. Адсорбция этих ионов протекает по механизму химической адсорбции. Ионы K+ и NO3– непосредственно на поверхности кристалла адсорбироваться не могут, так как не способны достроить кристаллическую решетку или образовать с ионами поверхности кристалла AgCl труднорастворимые соединения.

При адсорбции ионов Cl– на поверхности кристалла AgCl генерируется отрицательный электрический заряд и возникает потенциал, который приостанавливает дальнейшую адсорбцию ионов Cl–. Этот потенциал называют электротермодинамическим или -потенциалом ("фи"-потенциал). Ионы, создающие такой потенциал, называются потенциалопределяющими.

Имеющиеся в растворе ионы K+ притягиваются к отрицательно заряженной поверхности вследствие кулоновских (электростатических) взаимодействий и адсорбируются, частично нейтрализуя ее заряд. Ионы, противоположные по знаку потенциалопределяющим ионам, называют противоионами. Адсорбция противоионов протекает по механизму физической адсорбции.

В результате, на поверхности кристалла AgCl образуется двойной электрический слой, состоящий из плотного адсорбционного и диффузного слоев (рис. 4.1, а).

Рис. 4.1. Строение двойного электрического слоя на поверхности а) кристалла хлорида серебра, б) частицы диоксида кремния

В адсорбционный слой входят потенциалопределяющие ионы Cl–, прочно хемосорбированные на поверхности кристалла, и часть противоионов K+,

40