Лабораторна робота № 4. Складні (диференційні) методи фарбування мікроорганізмів

Теоретична частина

Діагностичний метод фарбування за Грамом

Найбільш поширений метод, при якому виявляється здатність бактерій утримувати барвник (грампозитивні бактерії) або знебарвлюватися в спирті (грамнегативні бактерії). Відношення бактерій до фарбування за Грамом визначається їх здатністю утримувати що утворився в процесі фарбування комплекс генціанового фіолетового з йодом. Це залежить від відмінностей у хімічному складі і проникності клітинної стінки Гр«+»і Гр «-» бактерій. У Гр«+»мікроорганізмів пептидоглікан багатошаровий, містить тейхоєвікислоти. У Гр «-» -пептидоглікан одношаровий, є зовнішня мембрана, яка містить фосфоліпіди, ліпопротеїди, білки. Генціанвіолет і йодутворюють міцне танерозчиннез'єднання з багатошарової муреїновою сіткоюГр«+»бактерій.Гр «-» бактерії такий комплекс не утворюють, їх муреїн одношаровий і фарба з них вимивається.

Фарбування за Грамом

1. На фіксований мазок накладають шматочок фільтрувального паперу і на нього наливають карболовий розчин генціанового фіолетового. Через 1 хв.папір знімають і барвник зливають.

2. На мазок наливають розчин Люголя на 1,5 хв.(мазок чорніє).

3. Злити розчин Люголя і обробитипрепарат в 95% етанолу протягом 35 сек.

4.. Промити водою.

5. Забарвити розведеним фуксином протягом 2 хв.

6. Змити фарбу, висушити фільтрувальної папером, мікроскопірувати.

Мікроскопічна картина: Гр«+»бактерії фарбуються у фіолетовий колір, Гр «-» - в рожево-червоний.

Фарбування за Цилем-Нільсену

Використовується для фарбування кислотостійких мікробів. Для збільшення ступеня проникності бактерій препарат фарбують фуксином Циля при підігріванні. Пофарбованікислотостійкі мікроорганізми потім не знебарвлюються слабкими розчинами мінеральних кислот і спиртами

1. Фіксований мазок покривають фільтрувальної папером і наливають фуксин Циля. Потім, утримуючи препарат пінцетом, підігрівають його над полум'ям спиртівки (h = 10 см) до відходження парів. Повторюють маніпуляцію 2 рази.В міру необхідності додають фарбу не знімаючи папір з препарату.Папір знімають тільки після охолодження препарату.

2. Препарат знебарвлюють 5% розчином сірчаної кислоти. Потім ретельно промивають водою.

3. Забарвлюють водно-спиртовим розчином метиленового синього протягом 4 хв., промивають водою, висушують і мікроскопірують.

Мікроскопічна картина: кислотостійкі бактерії фарбуються в рожево-червоний колір, інші форми набувають синє забарвлення.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, етиловий спирт, світловий мікроскоп, штативи, предметні скла, набір барвників для фарбування за методами Грама та Циля-Нільсона, імерсійна олія, досліджувальна культура м/о.

2.1.Приготувати фіксований мазок-препарат культури мікроорганізмів. Забарвити за методом Граму. Нарисувати. Відмітити Грам-позитивні та Грам-негативні м/о.

2.2. Приготувати фіксований мазок-препарат культури мікроорганізмів. Забарвити за методом Циля-Нільсона. Нарисувати. Відмітити кислотостійкі та кислотонестійки бактерії.

3.Контрольні питання

3.1.Поняття про складні методи фарбування мазків.

3.2.Мікробіологічні та біохімічні аспекти фарбування за методами Грама та Циля-Нільсона.

3.3. Правила фарбування за методом Грама.

3.4. Правила фарбування за методом Циля-Нільсона.