1,6 Фотоприемники; 2 кварцевые окна; 3 проточная ячейка; 4 источник уф- излучения; 5 фильтр
Одной из основных проблем конструирования фотометрических детекторов является обеспечение возможности фотометрирования в достаточно широком диапазоне длин волн. Это необходимо для получения максимальной чувствительности на длине волны, соответствующей ширине полосы максимального поглощения вещества.
Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника излучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого до измерительной ячейки или после нее.
Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа – 254; 303; 313; 365; 464; 436; 546 нм и т.д.), другие – непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа – 190-600 нм). Интенсивность их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинакова.
Характерной особенностью многих фильтровых УФД является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяют кадмиевую и цинковую лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Применяют также преобразователи излучения с 254 на 280-290 нм и другие длины волн, отсутствующие в спектре ртути.
Спектрофотетрический детектор предназначен для фотометрирования элюата, выходящего из хроматографической колонки, при различных длинах волн в достаточно широком спектральном диапазоне (обычно 190 - 360 нм). СПФ состоит из источника света, монохроматора и фотометра. В качестве источника света используется дейтеривая лампа. Изменение длины волны осуществляется поворотом дифракционной решетки монохроматора (3600 штрихов на 1 мм) с помощью шагового двигателя. Монохроматический световой пучок, управляемый вибратором, поочередно проходит через рабочую и сравнительную проточные ячейки, после чего производится измерение разности в интенсивности обоих пучков.
а б
Рис. 31. Фотодиодные УФ-детекторы для жидкостной хроматографии с механическим движущимся фотодиодом (а) и с фотодиодной матрицей (б):
1 Источник уф-излучения; 2 диафрагма; 3 конденсор; 4 проточная ячейка; 5 дифракционная решетка; 6 фотодиод; 7 фотодиодная матрица
В современных СПФ детекторах часто находит применение фотодиодная матрица. Оптические схемы двух типов фотодиодных УФ-детекторов приведены на рис. 31. В таких детекторах непрерывное излучение источника 1 проходит через проточную рабочую ячейку 4 и попадает на дифракционную решетку 5. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости, где расположен механически движущийся фотодиод 6, сканирующий спектр по мере движения вдоль него, или фотодиодная матрица. В последнем случае спектр проецируется на матрицу, состоящую из 200 - 250 элементарных фотодиодов, и выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн с дискретностью 2 - 5 нм. Обработка и запись спектров проводится с помощью компьютера.
К фотометрическим детекторам относится также детектор, работа которого основана на поглощении света в инфракрасной области спектра (ИКД). Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК - спектрах этих соединений, поэтому ИКД пригоден для идентификации органических соединений. Одним из основных условий работы ИКД является прозрачность применяемых растворителей в ИК - области спектра. Наиболее подходящими, однако редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются CCI4 ,CHCI3 и CS2.
Адсорбция ИК - света может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования. Если ранее детекторы этого типа применяли главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время они всё шире внедряются в высокоэффективную жидкостную хроматографию.
Для фотометрических детекторов постоянно ведется поиск новых источников излучения, конструкций проточных ячеек, методов регистрации и обработки сигналов. Эти исследования, несомненно, расширят применение фотометрических детекторов.
Рефрактометрические детекторы (РМД) в отличие от фотометрических детекторов, реагирующих только на вещества, поглощающие свет в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра, являются наиболее универсальными детекторами в жидкостной хроматографии. Принцип действия РМД основан на дифференциальном измерении показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления. РМД обладает средней чувствительностью, а его показания в сильной степени зависят от колебаний параметров, влияющих на состав подвижной фазы, таких как давление, температура и концентрация анализируемого вещества. Поэтому РМД практически непригоден для градиентной хроматографии.
В некоторых случаях могут быть выбраны пары растворителей, имеющих близкие показатели преломления. При этом становится возможным осуществить градиентное элюирование в определенных пределах концентраций смеси растворителей.
Недостатками детектора являются также его нечувствительность к веществам, имеющим показатель преломления, одинаковый с растворителем, и более низкая чувствительность по сравнению со спектрофотометрическими детекторами.
Работа большинства современных РМД основана на трех различных принципах измерения сигнала: отклонении, отражении, интерференции.
В первом методе угол отклонения монохроматического света, проходящего через проточную оптическую ячейку, пропорционален концентрации пробы и контролируется электромеханическим устройством, движение которого преобразуется в электрический сигнал.
Другой метод измерения основан на законе отражения света (закон Френеля), согласно которому интенсивность отраженного света, подающего на поверхность границы раздела жидкости и стекла, пропорциональна углу падения и разности показателей преломления двух сред. Преимуществом детекторов, работающих на этом принципе, является меньший объем ячеек (< 3 мкл), в связи с чем они могут работать при небольших расходах элюента и с высокоэффективными колонками. Однако чувствительность таких детекторов в 50-100 раз ниже чувствительности других типов РМД.
Работа РМД третьего типа основана на интерферометрическом принципе сдвига.
Различие показателей преломления рабочего и сравнительного потока элюента приводит к разнице в длине оптического пути, которая измеряется интерферометрическим РМД как изменение длин волн света. Показания этого типа РМД достаточно линейны, а чувствительность в 10 раз выше, чем для других РМД. При оптимальных рабочих условиях возможно детектирование около 3 мкг/мл растворенного вещества. РМД может детектировать любой тип анализируемых веществ, независимо от температуры кипения, структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств. Детектор хорошо применим в тех случаях, когда нет необходимости в высокой чувствительности, например в препаративной хроматографии.
Принцип действия флуориметрического детектора (ФМД) основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение измеряют на выходе фильтра, не пропускающего лучи возбуждения. Длины волн флуоресцентного излучения всегда превышают длины волн поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности флуоресценции, ФМД более чувствительны по сравнению с детекторами поглощения.
Для измерения обычно используют два типа конструкций ФМД, представленных на рис. 32. Свет от УФ-источника излучения 1 проходит через фильтр 2 и фокусируется в проточной ячейке 3 с прямоугольной или (рис. 32 а) или линейной (рис. 32 б) конструкцией ввода и вывода света эмиссии. Излучение проходит также через фильтр 4 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При применении ФМД подвижная фаза не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине излучения.
Излучение проходит также через фильтр 4 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При применении ФМД подвижная фаза не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине излучения.
а б
Рис. 32. Прямоугольная (а) и линейная со сравнительной ячейкой (б) конструкция флуориметрических детекторов:
1 источник света; 2,4 фильтры; 3 проточная ячейка; 5 фотоприемник; 6 сравнительная ячейка; 7,8 полупрозрачные зеркала; 9 ловушка света. Сплошная линия свет возбуждения, пунктирная свет эмиссии
Для сильно флюорисцирующих веществ предел детектирования достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии. С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных его преимуществ. ФМД можно также применять для количественного определения микропримесей веществ и качественного определения ароматических углеводородов, биологически активных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.
Применение ФМД в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования многих соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки дает возможность увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает ФМД более специфичным. Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования.
В случае применения дискретных источников возбуждения для ФМД может быть получена более высокая интенсивность флуоресценции, большая воспроизводимость и меньший предел детектирования. Кроме Нg-лампы на 254 нм, применяют Zn-лампу на 214 и 308 нм и Cd-лампу на 229 и 326 нм.