13. Просторова структура глобулярних водорозчинних білків і основні механізми її стабілізації.

Головною рушійною силою утворення глобулярної структури є гідрофобні взаємодії. Але, щоб здійснювати певні функції, білок повинен мати дуже стабільну просторову структуру, яку гідрофобні взаємодії не можуть забезпечити: для їхньої реалізації достатньо просто витіснити воду з інтерфейсу між гідрофобними поверхнями. При цьому поверхні, тобто сегменти вторинної структури, яким вони належать, будуть зберігати певну свободу руху.

Саме така ситуація і спостерігається для проміжного стану, який реалізується при укладці білка - так званої розплавленої глобули. Першим етапом укладання є одночасне й досить швидке утворення вторинної структури та «злипання» сегментів вторинної структури за рахунок гідрофобних взаємодій. Загальна архітектура розплавленої глобули така сама, як у нативного функціонального білка, але спостерігаються значні рухи ділянок вторинної структури одна відносно одної - розплавлена глобула нагадує краплю рідини, де елементами, що рухаються, є ділянки вторинної структури. На другому етапі реалізується щільна упаковка глобули за рахунок вандерваальсових взаємодій - точна взаємна підгонка амінокислотних залишків з утворенням численних контактів між ними, без порожнин усередині глобули. Результатом є нативна глобула, яка є вже не краплею рідини, а твердим тілом. Твердість - найбільш характерна та важлива ознака білка, вона забезпечує наявність стабільної специфічної робочої поверхні, яка й виконує певну функцію. Решта молекули - лише каркас, який утримує цю робочу поверхню. Твердість забезпечує також надійність роботи білка, дозволяє уникнути розмивання специфічності. Адже молекула білка поводить себе як тверде тіло при зміні умов: витримує зовнішні зміни до певних меж, не змінюючись сама, а за цими межами руйнується як одне ціле - за принципом «усе або нічого».

Головні взаємодії, що стабілізують білкову глобулу:

• Гідрофобні взаємодії між неполярними амінокислотними залишками, розташованими в межах сегментів вторинної структури.

• Водневі зв'язки між пептидними групами в межах тих самих сегментів, які підтримують їхню структуру і, головне, забезпечують можливість занурення пептидних груп у гідрофобне ядро.

• Вандерваальсові контакти всередині глобули, які забезпечують остаточне «огранювання» структури та надають їй жорсткості.

Додаткову роль у стабілізації можуть відігравати: водневі зв'язки всередині глобули за участю певних амінокислотних залишків; електростатичні взаємодії на поверхні глобули; ковалентні дисульфідні зв'язки між залишками Cys (наближеними один до одного внаслідок реалізації головних факторів укладання); взаємодії з певними невеликими молекулами небілкової природи - лігандами, простетичними групами, іонами металів тощо.

14. Балансова теорія визначення статі Бріджеса.

Молекулярні механізми визначення статі, навіть у межах одного хромосомного типу, можуть кардинально відрізнятися. Розглянемо два різні механізми визначення статі за типом ХХ/ХY . у дрозофіли та ссавців. У дрозофіли наявні два типи статевих хромосом . Х і Y. Особини ХХ розвиваються як самки, а особини ХY . як самці. При цьому із зиготи, що має тільки одну Х-хромосому (Х0) також розвиваються самці, а набір статевих хромосом ХХY приводить до розвитку самки. Отже, генетично інертна Y-хромосома у дрозофіли взагалі не відіграє ролі у визначенні статі: ключовим моментом є співвідношення (баланс) між кількістю Х-хромосом і кількістю наборів аутосом (табл. 6.1) . це положення було свого часу сформульване Бріджесом (Calvin Bridges)

як балансова теорія визначення статі.

Таблиця 6.1. Співвідношення між числом Х-хромосом і кількістю наборів аутосом при визначенні статі у дрозофіли

ХХ АА 1,0 самка

ХY АА 0,5 самець

Х0 АА 0,5 самець

ХХY АА 1,0 самка

ХХХ АА 1,5 надсамка

ХХХY АА 1,5 надсамка

ХХ ААА 0,67 інтерсекс

Х0 ААА 0,33 надсамець

ХХХХ ААА 1,3 надсамка

За наявності в диплоїдній зиготі двох Х-хромосом, співвідношення між ними та кількістю наборів аутосом дорівнює 1 . саме за такої умови із зиготи буде розвиватися самка. Набір статевих хромосом ХY приводить до відношення Х : А, що дорівнює 0,5, і з зиготи розвивається самець. Набір Х0 зумовить таке саме співвідношення між Х-хромосомами й аутосомами, тому особини Х0 є самцями. Набір статевих хромосом ХХY визначить співвідношення, яке дорівнює 1, що забезпечить розвиток самки. За умови, що Х : А більше за одиницю, із зиготи розвивається надсамка, яка характеризується гіпертрофованими зовнішніми статевими ознаками самки; наслідком відношення, яке менше 0,5, є розвиток надсамця. Якщо відношення Х-хромосом до кількості наборів аутосом є проміжним між 1 і 0,5, із зиготи розвивається так званий інтерсекс, який характеризується проміжним між самцями та самками фенотипом.

Балансовою теорією пояснюється поява серед дрозофіл гінандроморфів . особин, які мають частину клітин, тканин чи органів з ознаками, характерними для різних статей. Під час ембріонального розвитку при перших поділах зиготи з набором статевих хромосом ХХ, одна

з Х-хромосом може бути втраченою (за механізмом виникнення анеуплоїдів), і відповідні клітини будуть родоначальниками тканин і органів, що розвиваються шляхом, характерним для самця.

Молекулярний механізм балансового визначення статі у дрозофіли пов’язаний із наявністю в Х-хромосомі двох генів . sis-a та sis-b, що виконують роль головного стать-детермінуючого сигналу. Білкові продукти цих генів утворюють комплекс із продуктом аутосомного гена da. Кількість продуктів гена da відповідає кількості аутосом (у диплоїдного організму . дві дози), а кількість продуктів генів sis-a та sis-b варіює залежно від кількості Х-хромосом у зиготі (одна або дві

дози). Таким чином, у самок утворюється вдвічі більше цих білкових комплексів, ніж у самців. Білкові комплекси sis-da виконують роль факторів транскрипції, під контролем яких знаходиться ключовий ген розвитку статі . Sxl (Sex-lethal), що міститься в одній із аутосом. Подвійна концентрація фактора транскрипції є достатньою для активації гена Sxl у самки; у самця (одна Х-хромосома) ген не транскрибується на найбільш ранніх стадіях ембріонального розвитку,

оскільки концентрація активатора транскрипції є недостатньою. Ген Sxl містить вісім екзонів і має два промотори . ранній і пізній. Фактор транскрипції sis-da активує ранній промотор, при транскрипції з якого (що відбувається тільки в самки) сплайсинг мРНК спрямований таким чином, що екзони 2 і 3 вирізаються з премРНК. Продуктом гена є білок Sxl, він виконує роль регулятора сплайсингу власного гена при його транскрипції з іншого . пізнього . промотора, що активується як у самця, так і в самки на трохи пізніших стадіях розвитку ембріона. Транскрипція з пізнього промотора зумовлює трохи інший шлях сплайсингу, коли в мРНК залишається скорочений екзон 1 разом з екзоном 2. Регулятор сплайсингу Sxl забезпечує вирізання екзона 3 у самки, у самця (за відсутності Sxl) цей екзон залишається. Оскільки екзон 3 містить стоп-кодон, трансляція мРНК у самця приводить до синтезу нефункціонального поліпептиду. У самки синтезується трохи змінена форма білка Sxl, яка підтримує сплайсинг власної мРНК шляхом, характерним для самки, а також виконує роль регулятора сплайсингу мРНК гена tra(transformer): у самки утворюється функціональна мРНК, у самця . нефункціональна, яка містить стоп-кодон у екзоні 2.

Функціональний білковий продукт гена tra, у свою чергу, спрямовує сплайсинг мРНК гена dsx (double-sex) за типом самки: у мРНК наявні перші чотири з шести екзонів . за екзоном 4 розташований polyA-сигнал, який у присутності білка Tra впізнається системою процесингу. У результаті утворюється білок dsxF, який зумовлює розвиток самки, запускаючи активацію відповідного каскаду генів. За відсутності білка Tra в самця вказаний polyA-сигнал не розпізнається, і синтезується мРНК, що містить усі шість екзонів. відповідний білок dsxM зумовлює активацію генів, які відповідають за розвиток ознак самця. У ссавців, як і в дрозофіли, особини з набором статевих хромосом XX мають жіночу стать, а з набором XY . чоловічу. Але, на відміну від

дрозофіли, особини Х0 (при втраті Y-хромосоми) мають жіночу стать, а особини з додатковими Х-хромосомами (ХХY, ХХХY, ХХХY) . чоловічу. Отже, у визначенні статі у ссавців ключову роль відіграє Y-хромосома: за її наявності розвивається особина чоловічої статі, за відсутності . жіночої. Визначальна функція Y-хромосоми зумовлена наявністю в її складі ключового гена TDF/SRY (Testis Determining Factor/ Sex determining Region Y), продукт якого є транскрипційним фактором для генів, котрі визначаютьрозвиток тестикул (чоловічих гонад) у зародку