8.Методы выделения и очистки белка.Электрофорез,хроматография,фракционирование солями и органическими растворителями.

Последовательность операций по выделению белков состоит в следующем: измельчение биологического материала (гомогенизация); извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция); выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка. Гомогенизация биологического материала.Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани

животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т.е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов

Длявыделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы .Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки,вызванное кристаллами льда. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты –

вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами. Фракционирование и очистка белков.После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные

методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию. Хроматография- разделение белковых смесей заключающийся в пропускании подлежащей функционирования белковой смеси через колонку, заполненную адсорбентом.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние

последовательно собирают в коллекторе фракций.При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную(В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.), распределительную(осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы

применяют влажный крахмал или силикагель),ионообменную(Ионообменные смолы являются поли-

мерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен) и аффинную(Основана на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными)на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент),антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д.

Электрофорез-основан на способности белков перемещаться под действием электрического поля с неодинаковой скоростью а растворе,на влажной фильтровальной бумаге и т.д. В последнее время более широкое распространениеполучили методы зонального электрофореза белков на различных

носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества состоят в том, что исключается размывание

границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, нетребуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка.Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков является диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель.

Метод изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических

полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

Методо фракцирования белков солевыми растворами основан на том, что каждый индивидуальный белок,выделяемый из смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, при том как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе.Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливание.Из органических растворителей для фракционирования белков применяются метиловый и этиловый спирты(применяется при выработке заменителей крови).

Очистка белков(для полного освобождения от примесей): методы очистки-диализ-длительное пропускание воды через сосуд,в кот.погружен диализационный мешочек. При диализе применяют полупроницаемые мембраны(целлофан,коллодийнаяпленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры.

Ультрафильтрация основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.Гельфильтрация-зерна сефадекса долго удерживают низкомолекулярные вещества(гель сефадекса).