Глава 3. Методы культивирования микробов

Для изготовления каждого специфического препара­та, применяющегося как для профилактики и лечения, так и для диагностики инфекционных заболеваний, тре­буется иметь в том или другом количестве микробов их антигены или токсины. Последние получают на производстве бактерийных и вирусных препаратов путем культивирования микробов. С этой целью бактерий раз­множают на искусственных, естественных, полусинтети­ческих или синтетических питательных средах. Риккетсии и вирусы культивируют в организме чувствительных животных (иногда членистоногих), различных частях куриного эмбриона или культурах тканей первичных или перевиваемых клеток.

Культивирование бактерий

Как было указано выше, бактерий размножают на искусственных жидких и плотных (агаровые) питательных средах. Применяются различные среды в зависимо­сти от особенностей бактерий и цели, которую преследу­ют при размножении их.

Применяемые в производстве пита­тельные среды делятся на белковые, промежуточные между белковыми и синтетическими и синтетические.

К первой группе прежде всего относятся среды с нативными белками (агар Бейли с асцитом для культи­вирования гонококка, среда Бордэ-Жангу с кровью для коклюшной палочки). Сюда же относятся среды с высоким содержанием «белкового азота» (бульон Рамана для изготовления столбнячного анатоксина, дрож­жевой агар для культивирования бактерий кишечного семейства и др.) и среды с незначительным содержани­ем «белкового азота» (среда для получения стафило­коккового токсина из кислотного гидролизата, автолизата отрубей и дрожжевого экстракта).

К промежуточным средам относятся, с одной сторо­ны, среды с основой в виде ферментативного или кис­лотного гидролизата казеина с цистином или триптофаном (среды, применяемые при производстве противотуляремийной вакцины) или с основой из аминокислот и незначительных количеств казеиновых гидролизатов (полусинтетические среды для производства кишечных вакцин).

Синтетические среды широко применяются для куль­тивирования туберкулезной палочки, при производстве туберкулина и штамма ВСО для изготовления противо­туберкулезной вакцины. Примером может быть гликоколевая среда ВКЛ, содержащая КС1, М₂S0₄, лимоннокислый натрий, глицерин, глюкозу и гликокол. Предложены подобные среды и для культи­вирования других бактерий (синтетическая среда для выращивания тифопаратифозных и дизентерийных бак­терий, для изготовления химической вакцины против кишечных инфекций, содержит двузамещенный лимон­нокислый аммоний, глюкозу, никотиновую кислоту триптофан, цистин и глютаминовую кислоту).

Преимуществом синтетических сред является то, что они имеют известный состав. Искусственные питатель­ные среды подвергаются химическому контролю на со­держание общего и аминного азота, пептонов, свободного триптофана, солей железа, хлоридов, определяется также рН. Все среды подвергаются стерилизации при различном режиме в зависимости от их состава.

Для получения токсинов экзотоксические бактерии (дифтерийные, столбнячные, ботулиновые, раневых ин­фекций и др.) засеваются на жидкие питательные среды, разлитые в бутыли различной емкости. Выращи­вание производится при 35-37 °С в течение 7-10 дней.

Получение бактерийной массы в больших количест­вах для изготовления вакцин производится глубинным методом, который заключается в том, что бактерии культивируются в жидкой питательной среде в специальных аппаратах — реакторах при постоянном продувании через среду стерильно­го воздуха.

В условиях аэрации процесс размножения микробов резко ускоряется. Если при стационарных условиях раз­множения на плотной питательной среде максимальный выход бактерий достигается через 24-48 часов культи­вирования, то при глубинном методе данный срок сок­ращается до 12-14 часов. При этом имеет место резкое увеличение выхода микробной массы.

При культивиро­вании на синтетических средах в условиях аэрации ко­личество бактерий за 14 часов, достигает 25 млрд., а на мясных средах — 50-60 млрд. в 1 мл, в то время как выращивание в стационарных условиях на тех же сре­дах приводит к накоплению 1-2 млрд. бактерий в 1 мл.

Быстрое размножение и накопление больших масс микробов зависит от того, что в условиях аэрации от­сутствует начальная стационарная фаза роста, проис­ходит интенсивное размножение в фазе положительного ускорения роста, в логарифмической фазе, при продол­жительной фазе отрицательного ускорения размножения.

В последнее время метод глубинного культивирова­ния усовершенствован дополнением к реактору пульта управления, с которого и производится регулирование процессов в реакторе. Установка обеспечивает возмож­ность проводить глубинное выращивание бактерий в стандартных условиях с регистрацией и автоматиче­ским регулированием температуры и рН, учетом окисли­тельно-восстановительного потенциала и регламентиро­ванием степени аэрации. При помощи специально смон­тированного мембранного насоса обеспечивается подача воздуха, свободного от каких-либо примесей. Использо­вание этой установки позволяет получать переход популяции в логарифмическую фазу роста и накопление больших количеств бактериальной массы в течение 6-7 часов.

Глубинный метод культивирования микробов в жидкой среде при­меняется не только для получения больших масс мик­робных тел, но и токсинов.