Культивирование риккетсий

Долгое время единственным методом культивирова­ния патогенных риккетсий было размножение их в ор­ганизме экспериментальных животных. В 1906-1909 гг. были изучены на обезьянах лихорадочные формы экспериментальных заболеваний — риккетсиозов группы Цуцугамуши, а в 1909-1911 гг. — на обезьянах и морских свинках группы сыпного тифа. В дальнейшем были изучены и другие формы (лихорадочно-скротальная, бессимптомная, легочная, перитонеальная, септическая, тестикулярная глазная, кожная) экспериментальных рик­кетсиозов.

Для производственных целей используется размно­жение риккетсий в легких белых мышей, которые являются наиболее чувствительными животны­ми для воспроизведения легочной риккетсиозной инфек­ции. Эта форма экспериментальной инфекции в виде риккетсиозной пневмонии регулярно развивается у бе­лых мышей при внутриносовом заражении вирулентной взвесью риккетсий. Наиболее чувствительны к зараже­нию молодые мыши весом 10-15 г. Инфицирование их производится под эфирным наркозом с инсталляцией в ноздри 10 капель риккетсиальной взвеси. При такой дозировке микроба заражается 93-95 % животных, при­чем, в подавляющем большинстве случаев, заразившие­ся мыши погибают на 4-5 день. Для течения риккет­сиозной пневмонии у белых мышей характерной является гипотермия. Температура снижается на 3-4 день после заражения до 28-33 °С и в дальнейшем перед смертью животных падает до 18-20 °С. Состояние гипотермии, очевидно, является особо благоприятным для размножения риккетсий. При вскрытии мышей, убитых на высоте инфекции или в случае их гибели, обнаружи­вается очаговая или разлитая (долевая) пневмония с красной гепатизацией, захватывающей от 50-75 до 100 % всей легочной ткани.

При микроскопическом исследовании окрашенных мазков из пораженного легкого обнаруживается огром­ное количество мелких палочковидных или кокковидных форм риккетсий, свободных и частью расположенных в клетках, особенно в септальных. В среднем из легко­го инфицированной мыши получают до 20-25 млрд. риккетсий.

В больших количествах риккетсий Провачека можно получить при воспроизведении легочного риккетсиоза у кроликов, разработанного П. Ф. Здродовским. У этого вида животных экспериментальная инфекция воспроиз­водится при внутритрахеальном заражении их значи­тельной дозой вирулентных риккетсий в комбинации с одновременным снижением у них температуры до 36- 37 °С и ниже на протяжении всего периода развития риккетсиозного процесса в легких. Кролики заражаются суспензией из одного риккетсиозного легкого мыши. Снижение у них температуры тела достигается с по­мощью люминалового наркоза, поддерживаемого в течение 72 часов, — срок, на протяжении которого у кро­ликов заканчивается созревание пневмонии и накопле­ние риккетсий в легких.

Вскрытие кроликов через этот срок обнаруживает у них бронхопневмонию очагового или сливного характера при наличии серой или красной гепатизации раз­личной выраженности и протяженности, с преимущест­венной локализацией в дорзальной части легких.

При микроскопическом исследовании легких в окра­шенных препаратах обнаруживается значительное или очень большое количество обычно палочковидных риккетсий, свободных и частью расположенных внутриклеточно. Несмотря на то, что вес пораженных легких у кроликов достигает 20 г, этот метод накопления риккетсий не смог конкурировать с получением риккетсий в больших количествах в легких белых мышей, которые, 1 по исследованиям М. М. Маевского, превращаются как бы в живую пробирку с обильной культурой риккетсий.

В прошлом для изготовления противосыпнотифозной вакцины Вейль использовал кишечники вшей, инфицированных риккетсиями Провачека путем микроклизмы, — зараженных путем кормления нимф вшей через эпидермомембрану. Такой метод размножения риккетсий для получения их в больших количествах рекомендуется в настоящее время некоторыми лабораториями только для изготов­ления концентрированного антигена для серодиагности­ки сыпного тифа.

Метод этот основан на том, что платяная вошь легко инфицируется риккетсиями Провачека как в молодых формах (личинки-нимфы), так и во взрослом состоя­нии. Разведение здоровых вшей производится, в спе­циальных отделениях лабораторий, занятых производст­вом указанного выше антигена.

В качестве доноров для кормления вшей принимают­ся в первую очередь лица, страдающие гипертонией, так как эта процедура, понижая кровяное давление, в зна­чительной степени устраняет болезненные явления, свя­занные с гипертонией. Доноры находятся под постоян­ным врачебным наблюдением. Вши от стадии личинки до полного развития и момента заражения закреплены за каждым донором.

Кормление вшей может также производиться через эпидермомембраны. В особую кормилку наливается нитратная или дефибринированная кровь здорового человека - донора. Кольцеобразная крышка этой кормилки имеет натянутую эпидермомембрану с трупа человека, соприкасающуюся с поверхностью крови. Подлежащие кормлению голодные вши помеща­ются на указанную мембрану, через которую они охот­но питаются кровью.

Насекомые содержатся в деревянных закрытых кор­мушках, покрытых, с одной стороны, мелкоячейной мельничной сеткой, через отверстия которой вши сосут кровь донора. В кормушке помещается 500 вшей. Кор­мушки со вшами сохраняются в картонных коробках, на дне которых приклеены две узкие полоски картона, чтобы кормушки не касались дна коробки своей сеткой, что облегчает проветривание кормушек. Кал вшей в форме мелких круглых черных зернышек выпадает сквозь отверстия сетки на дно коробки. Вши сохраняются в термостатах при температуре 33-35 °С, кормление происходит раз в сутки в течение 45 минут.

Для изготовления указанного выше антигена произ­водится введение, под бинокулярной лупой, взвеси рик­кетсий в кишечник вшей, укрепленных под пластинками соответствующего приспособления. Кроме такого метода можно использовать кормление насекомых инфицированной кровью по А. В. Пшеничнову. Через 4-8 дней после заражения через кишечник и 8-9 дней через эпидермомембрану наступает максимальное развитие риккетсий во вшах и гибель их. К этому сроку у насе­комых, зараженных по А. В. Пшеничнову, накапливает­ся до 30-60 млн. риккетсий.

В 1938 г. Кокс предложил производить размножение риккетсий в куриных эмбрионах путем заражения их в полость желточного мешка. Для этой цели используют 6-7-дневные эмбрионы. Вся работа по заражению ку­риных яиц и их вскрытию производится в боксах с тща­тельным соблюдением стерильности в работе. После дезинфекции 50 % спиртом и смазывания 5 % йодной настойкой скорлупы тупого конца яйца пробуравливают отверстие над вершиной воздушной камеры. Заражение яиц производится с помощью стерильного шприца с иг­лой среднего размера или пастеровской пипеткой. Жид­кость, содержащая риккетсии, вводится в дозе 0,4-0,5 мл. Отверстие в скорлупе закрывается расплавлен­ным стерильным парафином.

Зараженные яйца инкубируются в термостате при 35-37 °С. Максимальное накопление риккетсии происхо­дит от 6 до 8-10 дня.

Риккетсии размножаются в ткани стенки желточного мешка. В мазках из последнего риккетсии обнаружива­ются в свободном виде. П. Ф. Здродовский считает, что, как и при других формах риккетсиоза, при заселении стенки желточного мешка риккетсии ведут себя как внутриклеточные паразиты, но при повреждении нежной ткани желточной оболочки легко высвобождаются из клеток и представляются свободными формами.

Вскрытие зараженных яиц осуществляется следую­щим образом: вначале смазывается 5 % йодной настой­кой тупой конец яйца, и пинцетом на уровне нижней границы воздушном камеры циркулярно надламывается скорлупа. После вскрытия скорлупы и оболочки воздуш­ной камеры стерильно извлекается пинцетом желточный мешок и помещается в стерильную посуду для последующего превращения в суспензию в физиологическом растворе.

В настоящее время для накопления риккетсии широ­ко используется метод культуры тканей. Успешно осу­ществляется культивирование риккетсии в присутствии тканей или оболочек, покрытых мезотелием или эндоте­лием. В лаборатории П. Ф. Здродовского все виды рик­кетсии размножают, используя пульпу куриных эмбрио­нов. Доказано, что риккетсии хорошо размножаются при пониженном метаболизме клеток. В связи с этим размножение риккетсии в культуре ткани начинается только тогда, когда снижается ее метаболизм; макси­мальное накопление микроорганизмов происходит к 7-12 дню. Солевой состав в среде выращивания рик­кетсии обеспечивается жидкостью Тироде. Оптимальной реакцией среды является рН 7,4-7,8. Обильное раз­множение риккетсии происходит в аэробных условиях при 35-37 °С. Риккетсии культивируют в жидкой среде и на агаре. Жидкая среда представляет смесь жидкости Тироде обычного состава с сывороткой, в которой взвешены частички ткани, зараженные риккетсиями. Сыворотка морской свинки или кролика добавляется из расчета 1 часть ее к 3-5 частям жидкости Тироде. Для культивирования на агаре изготавливают Тироде — сы­вороточный агар, на 1/3 поверхности которого наносят тканевую пульпу. Этот агар может использоваться пов­торно (3-4 раза) при удалении засеянной эмбриональ­ной пульпы с ростом риккетсии и замене ее свежей тканью куриных эмбрионов.

Из представленного материала видно, что разрабо­таны различные методы культивирования риккетсии для производственных целей, но из них обычно чаще приме­няется размножение в легких белых мышей и в желточ­ных мешках куриных эмбрионов.