Вопрос 29. Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по фер-ментативной активности.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 клас¬сам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образу¬емые бактериальной клеткой, могут локали¬зоваться как внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис¬точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля¬ют крупные молекулы пептидов, полисаха¬ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо-ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про¬цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых слу¬чаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль-зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен¬тов можно определить при помощи диффе-ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по фер¬ментативной активности.

Наиболее ча¬сто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности мик¬роорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Че¬рез 3—5 дней посевы просматривают и отмечают харак¬тер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их опреде¬ления служат специальные индикаторные бумажки, ко¬торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разло¬жения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим при¬знаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продук¬тов. Для выявления этого используют среды Гисса, со¬держащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, маль¬тозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообра¬зования в жидкие среды опускают поплавки или исполь¬зуют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы оп¬ределить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный —при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению ам¬миака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов исполь¬зуют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — проме¬жуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свиде¬тельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешива¬ния микробных клеток с 1 % раствором перекиси водоро¬да.

Для определения цитохромоксидазы применяют ре¬активы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидро-хлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появ¬ляющемуся через 2—5 мин.

Для определения нитритов используют реак¬тив Грисса: По¬явление красного окрашивания свидетельствует о нали¬чии нитритов.