Вопрос 9Споры — своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строе¬ния клеточной стенки (рис. 2.8).

Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высуши¬вание, дефицит питательных вешеств и др.). Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов.

Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры не превыша¬ет диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых раз¬мер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называют¬ся клостридиями, например бактерии рода Clostridium (лат. clostridium — веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля—Нельсена в красный, а вегетативная клетка — в синий.

Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются ви¬довым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга.

Форма спор может быть овальной, шаровидной;

расположение в клетке —

1. терминальное, т. е. на конце палоч¬ки (у возбудителя столбняка),

2. субтерминаль¬ное — ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены)

3. центральное (у сибиреязвенной бациллы).

Процесс спорообразованя (споруляция) прохо¬дит ряд стадий, в течение которых часть цитоп¬лазмы и хромосома бактериальной вегетатив¬ной клетки отделяются, окружаясь врастающей цитоплазматической мембраной, — образуется проспора.

Проспору окружают две цитоплазматические мембраны, между которыми формиру¬ется толстый измененный пептидогликановый слой кортекса (коры). Изнутри он соприкаса¬ется с клеточной стенкой споры, а снаружи — с внутренней оболочкой споры. Наружная обо¬лочка споры образована вегетативной клеткой.

Споры некоторых бактерий имеют дополни¬тельный покров — экзоспориум.

Таким образом формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем и формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. Спора приоб¬ретает термоустойчивость, которую связывают с наличием в ней дипиколината кальция.

Спора долго может сохраняться из-за нали¬чия многослойную оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма. В почве, например, возбудители сибирской язвы и столбняка мо¬гут сохраняться десятки лет.

В благоприятных условиях споры прораста¬ют, проходя три последовательные стадии:

1. активацию

2. инициацию

3. вырастание

При этом из одной споры образуется одна бактерия.

Активация — это готовность к прорастанию. При температуре 60—80 °С спора активируется для прорастания.

Инициация прорастания длит¬ся несколько минут. Стадия вырастания характе¬ризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки и выходом проростка

Вопрос 10Цитоплазма занимает основной объем бак¬териальной клетки и состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включе¬ний и многочисленных мелких гранул — ри¬босом, ответственных за синтез (трансля¬цию) белков.

Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 8OS-рибосом, характерных для эукариотических клеток. Поэтому некото¬рые антибиотики, связываясь с рибосомами бактерий, подавляют синтез бактериального белка, не влияя на синтез белка эукарио¬тических клеток. Рибосомы бактерий могут диссоциировать на две субъединицы -- 50S и 30S. Рибосомные РНК (рРНК.) — консер¬вативные элементы бактерий («молекуляр¬ные часы» эволюции). 16S рРНК. входит в состав малой субъединицы рибосом, a 23S рРНК— в состав большой субъединицы ри¬босом. Изучение 16S рРНК. является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.

В цитоплазме имеются различные включе¬ния в виде гранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и

выполняют роль запасных веществ для пита¬ния и энергетических потребностей.

Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Толуидиновым синим или метиленовым голу¬бым волютин окрашивается в красно-фиоле¬товый цвет, а цитоплазма бактерии — в синий. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде ин¬тенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Метахроматическое окрашивание волютина связано с высоким содержанием полимеризованного неорганического полифосфата. При электронной микроскопии они имеют вид элек¬тронно-плотных гранул размером 0,1—1,0 мкм. Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не име¬ет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, пред¬ставленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК. При нарушении деления в ней может находиться 4 и более хромосом. Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после ок¬раски специфическими для ДНК методами: по Фельгену или по Романовскому—Гимзе. На электронограммах ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК, связанной определенными участками с цитоплазматической мембраной или мезосо-мой, участвующими в репликации хромосо¬мы. Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности — плазмиды (см. разд. 5.1.2.), представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Вопрос 11 Окраска по Граму. Все бактерии по отношению к окраске по Грамму делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которой нет у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генциан-виолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется.

Техника окраски по Граму.

- окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

- бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

- окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

- раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

- тщательно смыть спирт водой;

- окрасить водным фуксином 2 мин);

- промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.