8. Характеристика гистохимических методов

Длительное время для изучения химического состава клеток и тканей пользовались исключительно классическими биохи­мическими методами, в основе которых лежит суммарное определение химических веществ в размельченной ткани (гомогенате). Однако, несмотря на свои положительные качества, эти методы не обеспечивали полного представле­ния о локализации тех или иных химических веществ в различных структурных компонентах клеток и тканей и трудно было определить, к какой именно ткани относятся выявленные химические соединения. Поиски методов, с помощью которых можно было бы определять локализацию химических веществ в целостных микроструктурах органов и тканей, привели к созданию гистохимического метода, объединяющего в себе гистологи­ческий и биохимический методы.

При гистохимических реакциях неорганические и органи­ческие вещества, входящие в состав клеток, вступают в химическую реакцию с различными реактивами (красителя­ми) и образуют окрашенные продукты реакции. По степени интенсивности этих продуктов можно до некоторой степени судить и о количественном содержании химического веще­ства в той или иной структуре.

Новый метод получил широкое распространение в иссле­довательской практике. В настоящее время ни одна морфо­логическая лаборатория не обходится без применения гистохимических методик. Однако успешное владение ими требует усвоения определенных навыков и соблюдения ряда условий, так как в отличие от гистологических методик, носящих большей частью эмпирический характер, гистохи­мические основаны на определенных химических механизмах и обладают строгой специфичностью. Отсюда главное требование — особая точность и тщательность в работе. Критерием в оценке результатов гистохимической реакции является не только локализация химических веществ, но и интенсивность окраски исследуемых компонентов клеток и тканей, так как именно она свидетельствует о концентрации выявляемых веществ. Если при гистологической обработке материала возможны некоторые отклонения в ходе окраши­вания препарата, то приемы, используемые для подготовки материала и проведения гистохимических реакций, должны тщательно соблюдаться, ибо отклонения на любом этапе могут изменить ход реакции и в конечном итоге привести к неправильной оценке препарата.

Для создания надлежащих условий протекания химиче­ских реакций особое внимание нужно уделить приготовле­нию рабочих растворов, а также чистоте применяемой посуды и стекол, качеству реактивов и т. д.

В настоящее время гистохимия перешла на количественный уровень исследования с применением специальных приборов (цитоспектрофотометров), позволяющих доволь­но точно определять количественную характеристику интен­сивности окраски (продукта реакции), что особенно важно для оценки состояния метаболизма в исследуемых органах, тканях и отдельных клетках. Это еще в большей степени предъявляет повышенные требования к качеству проведения гистохимических реакций и соблюдению строгой стандарти­зации обработки сравниваемых объектов на всех этапах. Именно в этих целях в первую очередь применяют совмещение сравниваемых образцов в одном блоке с после­дующим получением срезов одинаковой толщины на одном стекле. Когда это сделать невозможно, необходи­мо в ходе резки располагать разные срезы на одном предметном стекле. При любом способе совмещения сравниваемые срезы следует подвергать всем этапам гисто­химических реакций одновременно, используя одни и те же порции реактивов.

Одним из ус­ловий нормального протекания гистохимических реак­ций является соответствующий уровень рН среды. Сте­пень кислотности раствора зависит от концентрации ио­нов Н⁺, а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН. В химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно, через водородный по­казатель (рН), представляющий собой логарифм концен­трации ионов Н⁺, взятый с обратным знаком. Так, при рН 7,0 концентрация ионов Н⁺ равна концентрации ио­нов ОН^- и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем по­казатель рН меньше 7,0, тем концентрация ионов Н⁺ выше и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем рН больше 7,0, тем меньше ионов Н⁺ в растворе и более выражены его щелочные качества.

Для окрашивания гликозаминогликанов соединительной ткани требуется кислая среда. Разные ферменты тре­буют для проявления своей активности разные значения рН. Для щелочной фосфатазы оптимальная рН — 9,0, для кислой — 5,0. Оптимальные условия для проявления активности фермента создаются введением в среду инку­бации буферных смесей с заданным значением рН. Наи­более распространенными являются фосфатный, ацетат­ный и трис-буфер. Фосфатный буфер поддерживает рН среды от 6,0 до 8,0, ацетатный – от 3,6 до 5,6, а трис-буфер – от 7,2 до 9,0. Буферные растворы могут сохраняться длительное время, но их рН перед употреблением нужно проверять. Грубая проверка может быть осуществлена с помощью индикаторной бумаги, более точная - посредством специального прибора – потенциометра (рН - метра)