Выявление гидролаз

Из группы гидролитических ферментов рассмотрим способы выявления щелочной и кислой фосфатаз и аденозинтрифосфатазы. Первые два фермента неспецифичны. Они катализируют реакции переноса фосфатных групп (тран-сфосфорилирование) с одних органических соединений на другие, а также участвуют в гидролизе эфиров фосфорной кислоты.

Аденозинтрифосфатаза осуществляет гидролиз аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), являющейся основным поставщиком энергии для обменных процессов в органах и тканях, в силу чего изучение активности этого фермента помогает получить представление об уровне энергетических процессов в исследуемых биологических объектах.

Принцип выявления фосфатаз сходен. Фермент, находя­щийся в исследуемой ткани, при соответствующих условиях (рН среды, температура) отщепляет ионы фосфата от находящегося в растворе субстрата (органическое фосфорсо­держащее соединение, специфичное для данного фермента). Имеющиеся в растворе ионы металла (кальция или свинца) тут же связывают фосфат, образуя нерастворимый бесцвет­ный осадок, который выпадает в месте локализации фермента. При обработке срезов сульфидом аммония [(NH₄)₂S] осадок приобретает коричнево-черную окраску. Сульфид амония можно заменить сульфидом натрия (Na₂S).

Выявление окислительно-восстановительных ферментов

Этот класс ферментов осуществляет важнейший этап обменных процессов в живых организмах — биологическое окисление различных веществ, образующихся в процессе обмена белков, жиров и углеводов.

В ходе биологического окисления происходят выработка и накопление энергетических ресурсов клетки, используемых ею для осуществления своих жизненных функций. Этот сложный многоступенчатый процесс совершается последо­вательно с помощью целой цепи, состоящей из ферментов и вспомогательных соединений. Суть его заключается в от­щеплении от окисляемого субстрата атома водорода и переноса его электрона к кислороду. При этом атомарный кислород, поступающий в ткани из крови, активируется и, соединяясь с протоном водорода, образует молекулу воды.

Столь важная роль окислительных ферментов в обеспе­чении обмена в органах и тканях определяет большой интерес к их изучению. Различают три основные группы окислительных ферментов: 1) дегидрогеназы, катализирую­щие первый этап окисления — отнятие водорода от субстра­та и перенос на промежуточное соединение окислительной цепи; 2) оксидазы, катализирующие перенос электрона от промежуточного соединения к кислороду; 3) пероксидазы, обеспечивающие перенос электрона к перекисям. Наи­большее применение в гистохимии окислительных фермен­тов получили методы выявления дегидрогеназ. Они основа­ны на свойстве солей тетразолия легко восстанавливаться (присоединяя электрон водорода), переходя при этом из бесцветной растворенной в воде соли в нерастворимые окрашенные в темно-синий цвет мельчайшие кристаллы формазана.

Необходимо знать, что если ткани содержат большое количество ли-пидов, то они искажают ход гистохимической реакции за счет собственного окисления, в результате выпадают грубые, неправильной формы, темные, крупные кристаллы. В этих случаях следует предварительно, поместить срезы на 1—2 мин в охлажденный (—5°, —10°С) ацетон.