16. Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый или малиновый.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Процесс окрашивания мазков

1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.

3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).

4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.

5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).

6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

17. Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводя его дистиллированной водой в соотношении 1:10. Состав РАСТВОРА ФУКСИНА ЦИЛЯ: основной фуксин – 1 г; спирт этиловый 96 % – 10 мл; фенол кристаллический – 5 г; глицерин – несколько капель; вода дистиллированная – 100 мл.

Метиленовый синий Леффлера готовят, прибавляя к 30 мл насыщенного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 % этилового спирта) 1 мл 1% NaOH или KOH и 100 мл дистиллированной воды.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру (3–5 мин) гранулы волютина у дифтерийных коринебактерий приобретают темно–синий, а палочка – голубой цвет. 

При сложных методах окраски мазков применяют два–три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Граму, Цилю–Нельсену, Нейссеру, Бурри–Гинсу, Романовскому–Гимзе и некоторые другие.

При окраске по НЕЙССЕРУ гранулы ВОЛЮТИНА у дифтерийных коринебактерий окрашиваются в сине–черный, а бактерия – в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий – 0,1 г, спирт – 2 мл, ледяная уксусная кислота – 5 мл, дистиллированная вода – 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20– 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 –3 мин окрашивают везувином (прокипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды).

Количественное содержание ПЕПТИДОГЛИКАНА, содержащегося в # стенке, определяет характер окраски бактерий и других прокариот по ГРАМУ. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине–фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5–20 % пептидогликана, – в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных. Техника окраски по Граму: 1. Фиксированный мазок 1–2 мин окрашивают раствором генцианвиолета (генцианвиолет – 1 г, этанол 96 % – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл; по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, которую смачивают 2–3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1–2 мин фуксином Пфейффера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают.

Для выявления грамположительных КИСЛОТО– И СПИРТОУСТОЙЧИВЫХ микобактерий туберкулеза и лепры, которые из–за большого количества в клеточных оболочках жировосковых веществ, миколовой кислоты и других оксикислот непроницаемы для разведенных растворов красителей, используют окраску по методу ЦИЛЯ – НИЛЬСЕНА. Окрашивание их по этому способу достигается при помощи концентрированного фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки микобактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и этилового спирта. Техника окраски. 1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой. 2. Препарат обрабатывают (обесцвечивают) 5 % раствором серной кислоты и промывают водой. 3. На мазок наливают водно–спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3–5 мин промывают водой и высушивают. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, – в светло–синий.

При необходимости дифференциации возбудителей лепры от микобактерии туберкулеза используют окраску мазков по методу Семеновича–Марциновского – микобактерии лепры окрашиваются в красный цвет, а микобактерии туберкулеза остаются неокрашенными.

Для обнаружения КАПСУЛ бактерий, плохо воспринимающих красители, используют метод БУРРИ–ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (наносят 2–3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3–5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

. Для окрашивания спор можно использовать метод по ОЖЕШКО: 1) протравка оболочки споры горячей кислотой; 2) окраска по Цилю–Нильсену.

18.

Ядро. Наличие ядерных субстанций (диффузное ядро) в бактериальной клетке не вызывает сомнений. Цитохимическим анализом доказано содержание в ядерном аппарате у бактерий 20―30%, хроматина и 6―10% дезоксирибонуклеиновой кислоты. Структурные компоненты клетки, такие, как ядро, рибосомы, мезосомы, митохондрии, отделяют путем дифференциального центрифугирования.