Лабораторная работа № 1 Тема: Обмен простых белков
Цель работы: проследить при помощи хроматографии распределение аминокислот в соответствии с их растворимостью в органических растворителях, практически наблюдать действие фермента желудочного сока пепсина, трипсина, липазы на разрыв пептидных связей и денатурацию белка.
Реактивы и оборудование: хроматографическая бумага, аланин, лейцин, глутаминовая кислота, чашка Петри, водонасыщенный раствор фенола, 0,1% спиртовой раствор нингидрина.
В организме белки распадаются до аминокислот, которые поступают к органам и тканям, где используются для биосинтеза белков, а также подвергаются различным превращениям. Часть аминокислот и их конечные продукты распада переносятся в кровь и в почки, а затем выделяются с мочой. Содержание аминокислот в крови является относительно постоянным и служит одним из показателей состояния белкового обмена в организме.
Хроматографический метод определения аминокислот. Разделение смеси аминокислот с помощью радиальной хроматографии
Этот метод был впервые предложен в 1903 г. русским ученым М.С. Цветом. В настоящее время он широко применяется для разделения и количественного определения белков, аминокислот, и многих других веществ в крови и в моче.
Он основан на различной способности аминокислот растворяться в органических растворителях.
Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным методом служит метод распределительной хроматографии на бумаге. Для этих целей необходима хроматографическая бумага, которая служит адсорбентом и где происходит передвижение аминокислот (также может быть использована фильтровальная бумага хорошего качества), водонасыщенный органический растворитель, в качестве которого применяют фенол, смесь бутилового спирта, уксусной кислоты или муравьиной.
Выполнение метода заключается в том, что на хроматографическую бумагу (ближе к концу) наносят исследуемую смесь аминокислот. Этот конец бумаги подсушивают, помещают в растворитель, который вследствие капиллярности бумаги постепенно всасывается в неё. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет в нем растворяться и передвигаться. Причем те аминокислоты, которые хорошо растворяются в органическом растворителе, будут переноситься по бумаге дальше, те аминокислоты, растворимость которых хуже, пройдут более короткий путь. Когда фронт растворителя будет приближаться к другому концу бумаги, процесс прекращается. Бумагу высушивают в шкафу и затем проявляют – обрабатывают реагентом, который даст с аминокислотами цветную реакцию. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде окрашенных пятен, находящихся на разном расстоянии от места нанесения аминокислот (линия старта). Скорость передвижения может быть выражена с помощью коэффициента распределения Rf, который представляет собой отношение расстояния (в миллиметрах), пройденного данной аминокислотой от линии старта до середины её пятна (а), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (б):
Rf
=
Коэффициент распределения является величиной постоянной для данной аминокислоты при данных условиях.
Ход работы: Бумажный диск хроматографической бумаги, диаметром 12 см делят простым карандашом на четыре части. В центре диска делают небольшой вырез (диаметром 05-1 см). В каждом секторе на расстоянии 3-4 мм от разреза в центре диска наносят карандашом точку (линия старта). Затем в отмеченную точку каждого сегмента наносят капилляром небольшую каплю растворов различных аминокислот (целесообразно использовать аланин, лейцин, глутаминовую кислоту и соответственно их смесь, так как коэффициенты распределения этих аминокислот сильно разнятся). Бумагу подсушивают. Из такой же бумаги делают небольшой фитилек и вставляют его в разрез в центре диска. Затем хроматограмму с фитильком помещают на чашку Петри, куда предварительно наливают водонасыщенного раствора фенола так, чтобы фитилек его касался. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют под вытяжкой при комнатной температуре на 1 час, т.е. до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до конца хроматограммы около 1 см. затем, хроматограмму вынимают и высушивают в сушильном шкафу при 80-1000С для испарения фенола и фиксации аминокислот. После чего хроматограмму проявляют, обрабатывая её 0,1% спиртовым раствором нингидрина с помощью пипетки или пульверизатора, и вновь высушивают при 1000С 5-8 минут. На проявленной хроматограмме в трех секторах будет по одному пятну и в четвертом три пятна, соответствующих аминокислотам в исследуемой смеси. Рассчитывают коэффициенты распределения отдельных аминокислот и аминокислот, находящихся в смеси. Затем, сравнивая их, определяют, какие же аминокислоты входили в состав смеси.