52. Реакция нейтрализации токсина антитоксином и реакция нейтрализации вирусов. Механизм, компоненты, постановка и применение.

Реакция нейтрализации. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки. Это связано с блокадой микробных антигенов антителами. т.е. их нейтрализацией. При постановке реакции смесь антиген-антитело вводят животным или вносят в культуру клеток.

Реакция нейтрализации применяется для титрования антитоксических сывороток и для определения типа токсина (при ботулизме, газовой гангрене). Основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать летальное действие токсина. Токсин смешивают с диагностической антитоксической сывороткой in vitro и затем вводят белым мышам in vivo. При соответствии типа токсина и антитоксической сыворотки мыши не погибают. Например, при определении типа экзотоксина у возбудителя ботулизма смешивают токсин с диагностическими сыворотками различных типов, затем смесь вводят белым мышам. По выжившей мышке устанавливают тип экзотоксина.

Ингредиенты, мл	Мыши
	1	2	3	4	5
Исследуемый материал	1	1	1	1	1
Сыворотки различных типов	№1	№2	№3	№4	-
Нормальная сыворотка	-	-	-	-	1
Инкубация при 370 30 мин
Заражение белых мышей внутрибрюшинно
Результат	выживание	гибель	гибель	гибель	гибель

Вывод: в исследуемом материале содержится экзотоксин к сыворотке № 1.

Реакция нейтрализации используется для выявления противовирусных антител или установления типа вируса. Иммунную противовирусную сыворотку смешивают с вирусом, и смесь вводят восприимчивым животным или заражают культуру клеток. При нейтрализации вируса антителами в первом случае животное выживает, а во втором случае – отсутствует ЦПД.

53. Реакции с применением меченых компонентов. Реакция иммунофлюоресценции (риф) и радиоиммунный анализ (риа). Механизм, способы постановки, компоненты реакций и их применение.

В настоящее время широко применяются серологические реакции с меченными тем или иным способом компонентами (антителами – АТ или антигенами – АГ). Они отличаются высокой специфичностью, позволяют быстро получить результаты, поэтому используются для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции – РИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, радиоиммунный анализ –РИА.

В качестве меток используются:1) флюорохромы – вещества, способные флюоресцировать при облучении ультрафиолетом (поглощают энергию света определенной длины волны и излучают свет большей длины волны): флюоресцеина изотиоцианат (зеленый цвет), фикоэритрин (оранжевый), родамин (красный); используются в РИФ;2) ферменты: пероксидаза хрена, галактозидаза, щелочная фосфатаза; вызывают расщепление субстрата с образованием окрашенных продуктов при взаимодействии с хромогеном; используются для ИФА;3) радиоактивные метки – используются в РИА.

РИФ (реакция Кунса) – основана на том, что антигены тканей или микроорганизмы после обработки иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах, что обнаруживается при люминесцентной микроскопии мазков. Т.о. обязательно используется люминесцентная микроскопия (т.е. данный метод является разновидностью микроскопического метода диагностики). Использование флюорохромов основано на том, что они способны вступать в химическую связь с антителами, не нарушая их иммунологической специфичности. Метод позволяет обнаружить микроорганизмы непосредственно в инфекционном материале, тканях животных и культурах клеток. Простота метода, не требующего выделения чистой культуры в сочетании с быстротой получения результатов, позволяют отнести РИФ в разряд экспресс-диагностики.

Различают 3 основные разновидности метода: 1) прямой; 2) непрямой; 3) непрямой с комплементом (антикомплементарная РИФ). Прямая РИФ. Компоненты (ингридиенты).1.Антигены тканей или микроорганизмы.2.Флюоресцирующая (люминесцирующая) иммунная антисыворотка – содержит известные антитела (против искомого антигена), меченные флюорохромами.

Антигенами могут быть культуры бактерий, грибов, простейших; препараты из материала от больных (кал при холере, мокрота при коколюше); инфицированные культуры клеток, срезы тканей.

Постановка реакции. 1. Исследуемый материал наносят на предметное стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне, 10 мин, при комн. t⁰), высушивают 20 мин, 37⁰С.2. На фиксированный мазок наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические антитела, меченные изотиоцианатом, 30 мин, 25⁰С (во влажной камере).

1.Промывка буферным раствором, 10 мин, 25⁰С.

2.Люминесцентная микроскопия: сначала при 40х, а затем – 90х (обращают внимание не только на наличие свечения, но и его интенсивность, характер распределения).

Учет реакции. «+» реакция – клетки светятся (видимый эффект) по периферии в виде каймы желто-зеленого цвета в люминесцентном микроскопе.

Недостатком прямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих антисывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямая РИФ проводится с использованием двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ против искомого антигена, а затем образовавшиеся комплексы АГ-АТ обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые антитела против гамма-глобулинов того вида животного, которого иммунизировали при получении немеченой сыворотки (например, антиглобулиновая кроличья сыворотка, содержащая антитела к глобулинам кролика).

Если немеченая антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов, то на втором этапе используют меченую антивидовую кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации кроличьими гамма-глобулинами ослов или каких-либо других животных. Таким образом, необходимо иметь только антивидовую флюоресцирующую сыворотку.

При постановке непрямой РИФ:1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой 30 мин, 25⁰С и промывка 10 мин, 25⁰С – образуется несветящийся комплекс АГ-АТ (антитела покрывают антиген первым слоем);2) обработка антивидовой меченной сывороткой 30 мин, 25⁰С, промывка 10 мин, 25⁰С – антиглобулиновые меченные антитела связываются со специфическими антителами, которые служат для них антигенами (меченные АТ покрывают искомый АГ вторым слоем: АГ-АТ-АТ+флюорохром), вызывая свечение при люминесцентной микроскопии (т.е. АГ становится видимым в люминесцентном микроскопе).

Антикомплементарная РИФ предполагает применение меченых АТ против комплемента морской свинки. Для реакции используется комплемент, который фиксируется на комплексе антиген-антитело. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет увидеть АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.

При постановке РИФ с комплементом:1).обработка препарата немеченой специфической антисывороткой и комлементом морской свинки 30 мин, 25⁰С и промывка 10 мин, 25⁰С – образуется несветящийся иммунный комплекс (АГ-АТ), на котором адсорбируется комплемент (АГ-АТ-комплемент);2).обработка антикомплементарной меченной сывороткой (содержит антитела против глобулинов морской свинки) 30 мин, 25⁰С, промывка 10 мин, 25⁰С - комплекс АГ-АТ-комплемент взаимодействует с флюоресцирующим антителом к комплементу и полученный многокомпонентный комплекс (АГ-АТ-комплемент-АТ+флюорохром) светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Необходимо иметь только одну флюоресцирующую сыворотку – антикомплементарную.

Достоинством непрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при обнаружении различных антигенов. Это значительно удешевляет реакцию. Но с другой стороны по мере усложнения процедуры РИФ возрастает и возможность ошибок. РИФ нельзя отнести и к числу высокочувствительных реакций. Не исключается возможность неспецифической адсорбции меченых АТ на препарате.

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей (контроль с гетерологичным антигеном, контроль с неинфицированной культурой и т.д.). Применение лантаноидной метки (металлы лантаноидной группы) существенно повышает чувствительность метода.

Непрямой вариант РИФ можно использовать и для определения АТ в сыворотке больного. Для этого известный антиген (культура клеток, срезы тканей) наносят на предметное стекло и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам человека (антисыворотка к глобулинам человека). Этот метод используют для выявления антинуклеарных антител при аутоиммунных заболеваниях и антител к некоторым вирусам.

Радиоиммунный анализ ( РИА). Основан на том же принципе, что и ИФА, только вместо фермента вносится радиоактивная метка. Радиоактивность определяют по счетчику импульсов. Применение РИА связано с использованием сложной регистрирующей аппаратуры, и существенной биологической и экологической опасностью.

Иммуноблотинг. При постановке иммуноблотинга вначале препарат известного антигена фракционируют – разделяют методом электрофореза в агарозном геле на фракции (отдельные АГ). После этого гель накладывают на нитроцеллюлозную бумагу (фильтр), плотно прижимают к ней и создают электрическое поле, в результате происходит перенос фракций на бумагу (блоттинг). При этом сохраняется взаиморасположение фракций и их расстояние от старта (картина электрофореза). Далее обработку фильтра ведут также, как и при ИФА или РИА.

Учет результатов. Появление окрашивания фильтра в виде полос на тех местах, где располагались особые (специфические) фракции.