Занятие № 12

1. Тема: Лабораторное занятие по теме

Определение глюкозы в крови

Принцип метода: При окислении р-D –глюкозы кислородам воздуха под действием глюкозооксидазы (GOD) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (РОD) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски при длине волны 510 нм пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.

СОСТАВ НАБОРА

Реагент №1. Буфера

Фосфатный буфер рН 7,5.................................................150 ммоль/л

Фенол..................................................................................10 ммоль/л

Реагент №2. Лиофилизат

Глюкозооксидаза ..............................................................25000 ед/л

Пероксидаза........................................................................1500ед/л

4-аминоантипирин.............................................................0,16ммоль/л

Калибратор

Глюкоза...............................................................................10 ммоль/л

НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1. Фотометр, полуавтоматический или автоматический анализатор, длина волны 510 (490-510) нм.

2. Дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.

3. Вода дистиллированная или деинизованная.

4. Физиологический раствор.

5. Контрольные материалы с известным содержанием глюкозы, аттестованные данным методам.

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

Приготовление рабочего реагента: содержимое флакона с реагентом №2, аккуратно перемешивая, растворить в буферном растворе (реагент №1). Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после растворения лиофилизата в течение 20-30 минут при комнатной температуре.

Стабильность рабочего реагент: не менее 6 месяцев при 2-8 С, в темном месте. Приобретенное при хранении розовое окрашивание рабочего реагента ( до оптической плотности против воды не более 0,200; кювета-1см) не влияет на правильность определения концентрации глюкозы.

Калибратор: готов к использованию.

Необходимо выполнять калибровку для каждой серии реагентов, при изготовлении нового рабочего реагента и при длительном хранении приготовленного рабочего реагента.

Исследуемый материал (образец)

Свежая сыворотка (плазма) крови или моча. К сыворотке и плазме необходимо добовлять ингибитор гликолиза (натрия фторид). Не следует использовать для анализа гемолизированные или хилезные образцы.

В моче целесообразно предварительно провести качественную реакцию, а количественные измерения проводить только в пробах, дающих положительную реакцию.

Проведения анализа

Перед началом работы необходимо нагреть реагенты до выбранной температуры проведения анализа.

Качественная реакция: к 0,5 мл рабочего реагента добавьте 0,01мл мочи. Если через 15мин развивается розовое окрашивание- проба может быть использована для количественного определения глюкозы.

Количественный анализ:

Длина волны: 510нм (490-510)нм.

Длина оптического пути: 1см (5мм)

Температура инкубации: комнатная (18-25С)или 37С

Фотометрирование: против холостой пробы.

Внести в пробирки:	Опытная проба	Калибровочная проба	Холостая проба
Образец	0,01мл	-	-
Калибратор	-	0,01	-
Рабочий реагент	2,0мл	2,0	2,0мл

Пробы тщательно перемещать и инкубировать 15мин при 18-25 С или 10мин при 37С. Измерить оптическую плотьность опытной (Е) и калибровочной (Е) проб против холостой пробы.

Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет

Концентрацию глюкозы (С) в образце определить по формуле:

С= Е/Е х 10ммоль

Е-оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. плот;

Е-оптическая плотность калибратора, ед. опт. плот;

10ммоль/л- концентрация глюкозы в калибраторе, ммоль/л