Изучение последовательности разложения микроорганизмами отходов органической природы

Оборудование и материалы: Гелевые пластины, пропитанные минеральной средой Виноградского (в чашках Петри), солома, почва, стерильные колбы с 99 мл водопроводной воды, стерильные пипетки на 1 мл, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

Поскольку растительные остатки (в частности, солома) — сложные органические соединения, состоящие из раз­личных химических компонентов, а питание у микроорганизмов специфично, то представляет интерес смена микробных ценозов, участвующих в разложении растительных остатков с образованием гумусовых веществ.

Наибольшего внимания заслуживает разложение соломы в аэробных условиях. В качестве объекта исследования можно использовать овсяную (рисовую) солому. Овсяная солома со держит примерно 65% углерода и 0,65% азота (С : N = 100 : 1). Для процессов гумификации могут быть исследованы и другие отходы органической природы.

Экспериментальная часть

Опыт закладывают в чашках Петри на гелевых пластинах, что обеспечивает хорошую аэрацию и в определенной степени имитирует поверхностное внесение соломы в почву.

Для приготовления пластин из кремнекислого геля соляную кислоту плотностью (d) 1,9 в высоком цилиндре разбавляют водой до d=1,10 (на каждые 500 мл концентрированной соляной кислоты следует добавить примерно 500 мл дистиллированной воды). Жидкое стекло (Na₂O-3SiO₂ или K₂Si0₃) наливают в другой высокий цилиндр и разводят дистиллированной водой до d= 1,06—1,08 (на 100 мл жидкого стекла следует налить примерно 500 мл воды). Для установления плотности растворов пользуются ареометрами. Цилиндры и ареометры после разбавления жидкого стекла и кислоты тщательно отмывают.

Полученные после разбавления соляную кислоту и жидкое стекло смешивают в равных объемах; при этом второе вещество осторожно прибавляют к первому при постоянном помешивании. Чтобы устранить возможность появления в толще геля чечевицеобразных полостей, полученный раствор нагревают до кипения, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри слоем не менее 0,7 см. Через 8—10 ч образуется гель. Дав ему хорошо застыть и обсохнуть сверху, чашки с застывшим гелем помещают в эмалированную кастрюлю или большой стеклянный сосуд и ставят под кран для промывания. На водопроводный кран надевают толстую трубку, конец которой опускают на дно кастрюли или сосуда. Струя воды должна быть слабой. Промывают в течение 5—7 дней до исчезновения следов хлора 1%-ным AgNO₃ в присутствии НNO₃. Отмытые от следов хлора чашки с кремневыми пластинами окунают в кипящую воду, а при необходимости стерилизуют в кипятильнике Коха при 100 ⁰С 3 раза по 30 мин через 24 ч.

Отмытые от следов хлора гелевые пластины пропитывают 3-мя мл основной минеральной среды Виноградского без источников углерода и азота. Поскольку соотношение С: N в соломе может быть неодинаковым, к минеральной среде добавляют раствор азота в виде KNO₃ из расчета 26 мг азота на чашку.

В качестве единственного источника углерода на поверхность пластины помещают 1 г абсолютно сухой измельченной (3—5 мм) соломы или другого отхода. Солому увлажняют до 60% полной влагоемкости (ПВ) и добавляют к ней 1 мл почвенной суспензии 10^-2 разведения.

Затем не менее 20—30 чашек помещают во влажную камеру и в термостат при 25—28 ⁰С. Количество чашек рассчитывают, исходя из планируемых сроков анализа результата-опыта.

Периодически — через 15, 30, 45, 60, 75, 90… сут инкубации — вынимают по 2 параллельные чашки и подвергают их микробиологическому анализу. Сроки проведения анализов примерно приурочены ко времени разложения отдельных химических компонентов соломы (экстрактивных межклеточных веществ, целлюлозы, лигнизированной целлюлозы и лигнина). В последние сроки анализов в 2 параллельных чашках определяют содержание гумуса (фульвокислот и гуминовых кислот) в массе соломы и в геле. Извлекают гумусовые вещества 0,1 н. раствором NaOH по методу Тюрина. В вытяжках определяют углерод гуминовой кислоты и фул ьвокислоты.

При микробиологических анализах разлагающуюся солому рассматривают визуально и при увеличении микроскопа х8, х40 и х90, а также описывают родовой состав грибов, получивших развитие в соответствующие сроки разложения соломы. Затем солому снимают с поверхности геля и помещают в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают 10 мин, готовят разведения (10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 и т. д.) и делают поверхностные посевы на различные среды.

Учитывают сапротрофные бактерии — на МПА; бацил­лярные формы в состоянии спор после пастеризации суспензии — на МПА + сусло-агар; микроорганизмы, использующие минеральные формы азота, (в том числе актиномицеты) — на КАА; микроскопические грибы — на подкисленном сусло-агаре.

При развитии эпифитного гриба Fumago число хламидоспор определяют методом прямого счета. Для этого берут небольшую навеску соломы, готовят препарат в раздавленной капле и просматривают с иммерсионным объективом. Число хламидоспор во взятой навеске пересчитывают на общую массу соломы в чашке.

Микроорганизмы автохтонной группы (Nocardia, Мусоbacterium, Arthrobacter и Micromonospora) учитывают на нитритном агаре.

Результаты опыта с овсяной соломой, инфицированной суспензией дерново-подзолистой почвы, обычно свидетельствуют о том, что оптимальная численность грибов, выявляемых на сусло-агаре, отмечается на 15-е сут инкубации в период разложения экстрактивных веществ и активного разложения целлюлозы (через 90 сут. компостирования). Оптимальная численность сапротрофных бактерий, выявляемых на МПА, отмечается через 30—60 сут инкубации, а через 120 сут. и до конца опыта их численность резко падает. Микроорганизмы, использующие минеральные формы азота, в том числе актиномицеты, выявляемые на КАА, наиболее активно развиваются на 30—90-е сут разложения соломы. Оптимальное развитие целлюлозоразрушающих бактерий на среде Гетчинсона можно наблюдать через 30 и 90 сут инкубации. Через 120 сут разложения и до конца опыта их численность также резко падает. Численность микроорганизмов автохтонной группы, минерализующих лигнин и гумусовые вещества, резко возрастает со 150-х сут и до конца опыта.

Контрольные вопросы

1. Что подразумевается под компостированием?

2. Какие отходы подвергаются компостированию?

3. Какие организмы участвуют в процессах компостирования?

4. В чем заключаются химические процессы, которые происходят при компостировании?

5. Каковы оптимальные условия для процесса компостирования?

Лабораторная работа № 11

Выращивание дрожжей с использованием отходов

пищевого производства

Цель работы: изучить процессы периодического культивирования дрожжей на различных отходах пищевой промышленности, определить параметры их роста в различных условиях с использованием различных отходов производства.

Оборудование и материалы: весы технические, реактор для культивирования дрожжей, колбы для титрования, бюретки, H₂SO₄, сернокислый аммоний, меласса или другие отходы органического происхождения, бумажные фильтры, олеиновая кислота, 0,2 М р-р NH₄OH, 1-4 % р-р формалина, 0,2-0,5 % р-р хлорамина, суперфосфат, стандартные растворы йода и тиосульфата 0,12 н, раствор крахмала, раствор медного купороса или кобальта 0,001 моль/дм³, сульфит натрия кристаллический.