Экспериментальная часть

Для изучения спиртового брожения используют синтетическую среду следующего состава (в %): сахароза – 15,0; пептон – 0,5; КН₂РО₄ – 0,3; MgSO₄ – 0,1.

Опыт ставят в нестерильных условиях, однако благодаря созданию элективных условий – учету избирательных потребностей возбудителей спиртового брожения в среде будут развиваться преимущественно дрожжи. При этом жизнедеятельность других групп микроорганизмов будет подавлена.

100 мл среды наливают в плоскодонную колбу на 250-300 мл и вносят туда около 0,5 г прессованных или щепотку сухих дрожжей. Колбу закрывают каучуковой пробкой, в которую вставлен затвор Мейссля с резиновым клапаном Бунзена. Выход из колбы закрыт толстостенной резиновой трубкой с небольшим продольным разрезом (клапан Бунзена). Верхний конец резиновой трубки закрыт стеклянной бусиной. Затвор легко пропускает выделяющийся при брожении диоксид углерода, но испаряющаяся при инкубации в термостате влага, проходя через слой концентрированной серной кислоты, налитой в затвор, поглощается ею. Клапан также пропускает выделяющийся из колбы СО₂, но не дает возможности наружному воздуху проникать в колбу.

Колбу взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г и ставят в термостат при 25 ⁰С.

К условиям, способствующим преимущественному развитию дрожжей по сравнению с другими микроорганизмами, относятся: высокая концентрация сахара, слегка кислая реакция среды (за счет КН₂РО₄), анаэробные условия, накопление значительного количества спирта. Сумма этих факторов делает среду элективной для дрожжей.

Диоксид углерода, образующийся при брожении, определяют по разности массы колбы при постановке опыта и после его окончания. Завершение процесса брожения устанавливают по прекращению газообразования. Брожение обычно продолжается 2-3 дня. Несмотря на то, что колбу взвешивают только на технических весах, учет СО₂ получается достаточно точным, так как в процессе брожения его выделяется много. Почти 50 % сброжженных сахаров превращается в диоксид углерода (по уравнению реакции).

Определяют интенсивность дрожжевого брожения на различных вариантах субстрата (гидролизат различных отходов). Под интенсивностью брожения понимают отношение массы сброженного за определенный промежуток времени сахара к исходному его количеству в процентах. Допустим, что 15 г сахара подверглось брожению, в результате опыта было сброжено 12,3 г сахара, тогда интенсивность брожения равна 12,3/15*100=82 %. Для определения концентрации редуцирующих сахаров используют трифенилтетразолийхлорид (ТТХ), который восстанавливаясь углеводом, превращается в окрашенный трифенилформазан. Последний, растворяясь в органических растворителях, окрашивает раствор в вишнево-красный цвет.

Определение углеводов в культуральной среде проводят, предварительно освободив ее от клеток центрифугированием или фильтрованием, а также сделав соответствующие разведения при содержании сахара выше 200 мкг/мл. Супернатант (фильтрат) до определения глюкозы можно сохранять в холодильнике в течение нескольких суток, прибавив к нему несколько капель толуола.

К 2 мл культуральной среды, содержащей углевод, добавляют 1 мл бесцветного водного 0,3 %-го раствора ТТХ и 1 мл 2 н раствора NaOH. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 мин, затем вынимают из бани, немедленно подкисляют 1 мл 2,1 н раствором СН₃СООН для прекращения реакции. После охлаждения раствора объем жидкости доводят до 20 мл этанолом или изопропанолом. При этом развивается устойчивая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭК с зеленым светофильтром (=485 нм) в кювете с длиной оптического пути 3 мм.

Для перехода от показаний ФЭК к выражению количества углеводов в единицах массы строят калибровочную кривую, используя растворы, содержащие от 20 до 200 мкг глюкозы на 1 мл.

Необходимо также познакомиться с морфологией дрожжей. Для этого микроскопируют препарат бродящей жидкости. Готовят препарат и рассматривают под микроскопом при увеличении 40х или 90х. Определяют размеры дрожжевых клеток и наличие в них гликогена, а также подсчитывают процент живых (с метиленовым синим) и почкующихся клеток. Гликоген может накапливаться в цитоплазме дрожжей в виде гранул. При обработке клеток раствором Люголя он приобретает красно-коричневый цвет. Клетки дрожжей зарисовывают. Количество микроорганизмов в единице объема подсчитывают в соответствии с методикой [22].

После взвешивания бродильных колб, определения СО₂, редуцирующих сахаров, изучения морфологии клеток культуральную жидкость переносят в плоскодонную круглую колбу на 700-800 мл для отгонки этилового спирта. Колбу соединяют с обратным холодильником, устанавливают в колбонагреватель. При кипении жидкости спирт улетучивается вместе с парами воды и, охлаждаясь в холодильнике, каплями стекает в приемную колбу. Качественную реакцию на спирт можно осуществить с помощью бихромата калия. К 5 мл отгона прибавляют несколько капель 10 %-ного раствора H₂SO₄ и несколько мг K₂Cr₂O₇. При слабом нагревании образуется уксусный альдегид, температура кипения которого 21 ⁰С. Для его обнаружения отверстие пробирки покрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором нитрата серебра. При образовании уксусного альдегида, а значит, и при наличии спирта, бумага чернеет. Количественно концентрацию этанола в культуральной жидкости можно определить оксидометрическим методом, основанным на окислении этилового спирта до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотой. По окончании окисления спирта избыток бихромата оттитровывают раствором соли Мора. Определение количества этанола можно провести ферментативным методом с помощью набора реактивов «Фотоэтанол» («Импакт» Москва, Россия), а также методом газожидкостной хроматографии [22].