6.3 Этапы синтеза белка

Синтез белка (трансляция) является самым сложным из биосинтетических процессов: он требует очень большого количества ферментов и других специфических макромолекул, общее количество которых, видимо, доходит до трёхсот. Часть из них к тому же объединены в сложную трёхмерную структуру рибосом. Но, несмотря на большую сложность, синтез протекает с чрезвычайно высокой скоростью (десятки аминокислотных остатков в секунду). Процесс может замедляться и даже останавливаться ингибиторами-антибиотиками.

У всех живых организмов ДНК является первичным носителем генетической информации. Это значит, что в  структуре молекулы ДНК в виде последовательности нуклеотидов записана вся программа, необходимая для жизнедеятельности клетки, ее реакции на различные внешние воздействия.

У прокариот (доядерных организмов) вся наследственная информация представлена на одной кольцевой молекуле ДНК, состоящей из нескольких миллионов пар нуклеотидов. Иногда часть информации содержится в нескольких небольших кольцевых ДНК – плазмидах.

У эукариот  (имеющих клеточное ядро) ДНК в основном сосредоточена в хромосомах. В каждой хромосоме содержится одна двунитевая ДНК, размер которой достигает сотен миллионов пар нуклеотидов. Относительно маленькие молекулы ДНК содержатся в митохондриях. Они необходимы для синтеза митохондриальных РНК и митохондриальных белков. Двунитевая молекула построена по принципу комплементарности, т. е. когда каждая из четырех НК предпочитает взаимодействовать (образовывать водородные связи) только с одной НК из трех возможных. Так аденин взаимодействует через О-Н связи только с тимином (А-Т), а гуанин с цитозином (Г-Ц).

Синтез полипептидной цепи (ДНК, РНК или белка) в клетках складывается из трех основных этапов: инициации, элонгации и терминации.

Инициация  – образование связи между мономерными звеньями создаваемой полимерной цепи. Далее мономер присоединяется к образовавшемуся димеру, тримеру, тетрамеру и т. д. – это уже элонгация.

Элонгация – соединение очередного мономера с растущей полимерной цепью. Этот процесс происходит в активном центре фермента полимеразы. Затем участок полимера, к которому присоединился мономер, выдвигается из зоны активного центра фермента – это процесс транслокации.

Терминация – окончание сборки полимера. Для этого на матрице имеется определенный участок – терминатор (по его информации невозможно подобрать необходимый мономер).

Все процессы, происходящие с участием ДНК, можно разделить на два вида:

1) использование информации, записанной на ДНК, для синтеза молекул РНК, а затем клеточных белков;

2) сохранение, размножение и изменение информационного содержания молекул ДНК.

Каждая программа, записанная на ДНК, может быть многократно считана.

Способность ДНК к точному самоудвоению при произвольной последовательности нуклеотидов в ее цепях заложена и в самом принципе построения ДНК в виде двунитевой структуры со взаимно комплементарными последовательностями. Это означает, что каждая  из цепей содержит  полную информацию о строении противоположной цепи. При расхождении двунитевой ДНК каждая из цепей может воспроизвести другую цепь – это процесс репликации. Он реализуется при участии ферментов ДНК-полимераз. Матричный синтез ДНК выполняет две основные функции: репликацию (удвоение) ДНК, т. е. синтез новых дочерних цепей, комплементарных исходным матриксным цепям, и репарацию (восстановление) ДНК, если одна из цепей имеет повреждения. Но не всегда репарация способна восстановить первоначальную структуру ДНК, и процесс репликации происходит с поврежденной цепи ДНК. В этом случае происходит наследование повреждений – мутация.

ДНК-полимеразы катализируют перенос дезоксирибонуклеотидных фрагментов от АТФ, ГТФ, ЦДФ, ТДФ на гидроксигруппу растущей или подлежащей регенерации цепи ДНК, т. е. ДНК-полимеразы относятся к классу трансфераз. Раскручивание двунитевой спирали ДНК для доступа к ней ДНК-полимераз осуществляется двумя ферментами: геликазой и ДНК-топоизомеразой.

Кроме репликации, репарации и мутации ДНК может подвергаться гомологичной рекомбинации. Две близкие по своей первичной структуре молекулы ДНК, расположенные рядом, объединяются в четырехнитевую структуру. При этом соседние участки обмениваются фрагментами. Рекомбинация не создает новых генов, но в результате этого процесса возникают новые комбинации признаков, которые могут оказаться весьма существенными при естественном отборе.

ДНК программирует работу ферментов РНК-полимераз, которые катализируют синтез новых молекул РНК из нуклеотидов с последовательностью, комплементарной одной из цепей программирующей ДНК. Этот процесс называют транскрипцией (считывание). Конечным итогом является образование информационных, рибосомных и транспортных РНК. Образованная цепь РНК – первичный транскрипт – это еще не готовая РНК, и она подвергается дополнительной серии превращений – процессингу (отщеплению одного или нескольких нуклеотидов или наоборот присоединению, но уже без информации с ДНК). Синтез РНК начинается со вполне определенных участков ДНК и во вполне определенное время. Для этого на ДНК имеются участки, к которым присоединяются РНК-полимеразы и регуляторные молекулы. Эти участки не подвергаются считыванию и называются нетранскрибируемыми. 

Матричный биосинтез РНК (транскрипция) осуществляется при участии ферментов РНК-полимераз. Этот фермент катализирует такой же тип реакции, как и ДНК-полимераза (перенос нуклеозид-трифосфата на цепь РНК), но только вместо субстрата ТДФ используется УТФ. Матрицей при транскрипции является двунитевая ДНК. Вблизи активного центра РНК-полимеразы двунитевая спираль раскручивается, и фермент составляет цепь РНК по считываемой информации с нити ДНК. РНК составляется по принципу комплементарности с тем отличием, что вместо тимина используется урацил и нуклеозиды, которые содержат не дезоксирибозу, а рибозу.

Инициация проходит на строго определенном участке матрицы ДНК, он называется промотор, и именно с ним происходит специфическое взаимодействие активного центра РНК-полимеразы. После чего начинается синтез цепи РНК. ДНК содержит много таких промоторов, и при изменении условий РНК-полимераза может присоединяться к другому промотору. Так, при повышении температуры на 2,0–3,0 °С выше физиологического уровня РНК-полимераза присоединяется к промотору, с которого начинается считывание информации, необходимой для синтеза специальных защитных белков – БТШ.

Вновь синтезированная РНК еще не готова к выполнению своей функции и подвергается ряду превращений – процессингу. В нем принимают участие многие ферменты. Так, часто цепь РНК необходимо разрезать на несколько более коротких или подровнять концы, удалив лишние нуклеотиды, это осуществляют РНК-азы. Процесс транскрипции является точкой приложения многих биологически активных веществ, например антибиотиков и токсинов. Биосинтез белка согласно информации на РНК называется трансляцией (передачей). Он происходит на сложных надмолекулярных структурах – рибосомах, которые построены из рибосомных РНК и белков. АК для сборки новых полипептидных цепей поступают к рибосомам при участии тРНК, каждая из которых связывает по одной АК. Сборка полипептидной цепи осуществляется по информации, содержащейся на мРНК. В цепи мРНК информация о каждой АК записана в виде комбинации из трех нуклеотидов (например, УУУ или УУЦ-фенил-аланин, АУГ-метионин). Такие тринуклеотиды называются кодонами. На рибосомах происходит взаимодействие кодона мРНК с антикодоном тРНК. Антикодон тРНК – это тоже тринуклеотид, а сама тРНК имеет вид кленового листа (или креста). На малой субъединице рибосомы расположен участок, на котором взаимодействуют кодон мРНК с антикодоном тРНК – это декодирующий участок. Инициация синтеза полипептидной цепи начинается со взаимодействия между двумя остатками тРНК, один из которых несет на себе АК метионин (с нее обычно все и начинается). Отобраная АК переносится от одной тРНК на тРНТ, с которой и начинается синтез белковой цепи. Участок рибосомы, на котором происходит этот перенос, содержит фермент пептидилтрансферазу.  Он локализован на большой субъединице рибосомы. Молекула тРНК располагается одновременно на двух субъединицах. К начальной молекуле тРНК (с метионином) постепенно присоединяются различные АК посредством пептидной связи, пока на мРНК не встретится участок терминации. На этом синтез полипептида заканчивается.

Рибосомы, как и РНК-полимеразы, являются точками приложения действия ряда антибиотиков, так стрептомицин связывается с малой субъединицей рибосомы прокариот, хлорамфинекол – с большой вблизи активного центра пептидилтрансферазы. При этом тормозится синтез белка бактерий и не изменяется у животных.

Генетический код обладает рядом особенностей (рисунок 6.4). Во-первых, в коде отсутствуют «знаки препинания», то есть сигналы, показывающие начало и конец кодонов. Во-вторых, 3 нуклеотидных триплета (УАГ, УАА, УГА) не соответствуют никакой аминокислоте, а обозначают конец полипептидной цепи, а кодон АУГ сигнализирует о начале цепи либо (если он в середине последовательности) об аминокислоте метионине. Многие аминокислоты могут кодироваться несколькими различными кодонами. Все кодоны аминокислот одинаковы у всех изученных организмов: от вируса до человека. Создаётся впечатление, что все организмы на Земле происходят от единого генетического предка. Впрочем, в последнее время в митохондриях клеток человека были обнаружены кодоны, не совпадающие с «нормальным» словарём. Их наличие представляет собой загадку для ученых.

1

Рисунок 6.4 – Генетический код

Синтез белка требует больших затрат энергии – 24,2 ккал/моль. После окончания синтеза белок при помощи специального полипептидного лидера доставляется к месту своего назначения.

Синтез белка контролируют гены-операторы. Совокупность рабочих генов-операторов и структурных генов – называется оперон. Опероны не являются самостоятельной системой, а «подчиняются» генам-регуляторам, отвечающим за начало или прекращение работы оперона. Свой контроль гены-регуляторы осуществляют при помощи специального вещества, которое они при необходимости синтезируют. Это вещество реагирует с оператором и блокирует его, что влечёт за собой прекращение работы оперона. Если же вещество реагирует с небольшими молекулами – индукторами, это будет являться сигналом к возобновлению работы системы (рисунок 6.5).

Рисунок 6.5 – Синтез белка

Модель оперонов была разработана на микроорганизмах, но она соответствует и принципу работы генома эукариот. У последних гены образуют сложные системы, называемые супергенами, которые могут одновременно кодировать множество идентичных друг другу молекул белка. Все многоклеточные организмы развиваются из одной-единственной клетки – зиготы. Процесс дифференцировки клеток, видимо, связан с управлением синтезом белка генами-регуляторами, но каким конкретно образом осуществляется это управление – пока остаётся неясным.

Тематика лабораторных занятий

Лабораторное занятие 1

Биохимия пищеварения

Цель: Изучить свойства пищеварительных ферментов

Реактивы и оборудование: Амилоза слюны; крахмал (0,1 %-ный раствор); раствор Люголя (20 г йодистого калия и 10 г йода растворяют в 100 мл воды, для работы используют раствор, разбавленный в 5 раз); CuSO₄ (7 %-ный раствор); NaOH (10 %-ный раствор); трибутирин; буферный раствор (0,5 г мединала, или барбитала натрия, растворяют в 100 мл дистиллированной воды); раствор уксуснокислого кальция, 20 г/л (2 г (CH₃COO)₂Ca растворяют в 100 мл воды); инактивирующая смесь (90 мл 96 % этилового спирта и 10 мл диэтилового эфира); 0,1 н NaOH; раствор фенолфталеина, 10 г/л (10 мл); сыворотка крови; титровальная установка; спиртовка.

Опыт 1 Ферментативный гидролиз крахмала

под действием амилазы слюны

При участии амилаз крахмал подвергается последовательному гидролитическому расщеплению с образованием промежуточных продуктов распада – декстринов. Последние легко обнаружить по образованию окрашенных продуктов с раствором йода:

Продукты	Окрашивание с йодом
Крахмал	синее
Растворимый крахмал	синее
Амилодекстрины	Сине-фиолетовое
Эритродекстрины	красно-фиолетовое или красное
Ахродекстрины	буровато-желтое
Мальтодекстрины	не дают
Мальтоза	не дают

Конечный продукт гидролиза – мальтоза – может быть обнаружен реакцией Троммера или Фелинга.

Ход работы

В девять пробирок наливают по 2 мл воды и прибавляют по 2 капли 0,1 %-ного раствора йода в йодиде калия. В десятую пробирку наливают 5 мл 0,5 %-ного раствора крахмала, прибавляют разный объем разведенной в 10 раз слюны, быстро перемешивают и 2 капли смеси вносят в первую пробирку с раствором йода. Через 5–15 секунд (в зависимости от активности фермента) из десятой пробирки берут по две капли раствора и вносят во вторую, третью, ..., девятую пробирки, перемешивают и отмечают полу­чаемое окрашивание. При правильно выбранном интервале времени наблю­дается постепенный переход окраски растворов в пробирках от синей через красную (различных оттенков) до желтой (цвет раствора йода). С содер­жимым десятой пробирки проделывают реакцию Троммера. Отмечается появление красно-кирпичного осадка оксида меди (I).

Опыт 2 Определение активности липазы в сыворотке крови

Освободившиеся из расщепляемого липазой трибутирина жирные кислоты оттитровывают щелочью. По раз­нице в объеме раствора щелочи, которая требовалась на титрова­ние опытной и контрольной проб, судят об активности фермента.

Ход работы

В колбочки вместимостью 50 мл вносят по 0,2 мл трибутирина, 2,5 мл дистиллированной воды, содержимое встряхивают до получения однородной эмульсии. Затем добавля­ют по 5 мл раствора ацетата кальция и 5 мл буферного раствора; в опытную колбу вносят 0,5 мл сыворотки крови, тщательно пе­ремешивают и ставят в термостат для выдерживания при 37 °С в течение 1 ч. После этого во все колбы добавляют по 5,0 мл инактивирующей смеси, а в контрольную – дополнительно 0,5 мл сы­воротки крови. После перемешивания к содержимому колб приливают 0,5 мл раствора фенолфталеина и производят титрование 0,1 н раствором щелочи (NaOH или КОН) до появления устойчивой ярко-розовой окраски (вначале титруют контрольную пробу, за­тем опытную – до цвета содержимого колбочки с контрольной пробой).

Активность липазы выражают в пересчете на 100 мл сыворот­ки крови.

1 единица активности фермента – это мера активности, под дей­ствием которой за 1 ч инкубации при 37 °С из трибутирина высво­бождаются жирные кислоты, содержание которых соответствует таковому в 1 мл 0,1 н раствора жирной кислоты.

Расчет. От количества (мл) раствора щелочи, пошедшей на титрование опытной пробы, отнимают объем раствора щелочи (в мл), затраченной на титрование контрольной, и полученный ре­зультат умножают на 200. Ответ выражают в единицах активности липазы.

Пример. На титрование контрольной пробы ушло 0,4 мл раствора NaOH, а на титрование опытной – 1,2 мл.

Расчет:

(1,2 мл - 0,4 мл) • 200 = 160 единиц (на 100 мл сыворотки крови).

Норма: 60–160 ед. в сыворотке крови.

Лабораторное занятие 2

Обмен углеводов

Цель: Изучить методику определения глюкозы в крови и моче

Реактивы и оборудование: Ортотолуидин; ледяная уксусная кислота (х.ч.); раствор трихлоруксусной кислоты (30 г/л); тиомочевина; ортотолуидиновый реактив (0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл ортотолуидина); основной стандартный раствор глюкозы (27,80 ммоль/л).

В мерную колбу на 100 мл вносят 500 г высушенной до постоянной массы при 100 °С глюкозы и добавляют до метки раствор бензойной кислоты (2 г/л). Последний готовят следующим образом: 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, смесь нагревают на водяной бане до полного растворения. После охлаждения до комнатной температуры реактив переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки дистиллированной водой.

Бензойная кислота повышает стабильность стандартного раствора глюкозы. Хранят растворы стандарта в холодильнике.

Центрифужные пробирки; микропипетки; центрифуга типа ОПН-3; кипящая водяная баня; ФЭК с кюветами с шириной 10 мм.

Опыт 1 Определение глюкозы в крови и в моче

Определение глюкозы в крови

Ход работы

В центрифужную пробирку вносят 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты и добавляют 0,1 мл крови, взятой микропипеткой из пальца обследуемого. Смесь взбалтывают, центрифугируют (на клинической центрифуге типа ОПН-3 в течение 15 мин при 1500 об/мин). К 0,5 мл центрифугата приливают 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Пробирку со смесью помещают в кипящую водяную баню ровно на 8 мин (!), охлаждают ее под краном холодной водой (или в водяной бане). Пробы колориметрируют на ФЭКе при красном (600–650 нм) или желто-оранжевом (длина волны 595 нм) светофильтре в кю­вете с шириной слоя 10 мм. Аналогичный режим фотометрии ис­пользуют при выполнении исследований на современных изме­рительных устройствах типа биохимического полуавтоанализатора РУ1251-С«СОЛАР».

В качестве раствора для сравнения вместо контрольной пробы можно использовать дистиллированную воду, поскольку показа­тели их абсорбции практически одинаковы.

Для постановки контрольной пробы следует к 4,5 мл ортотолуидинового реактива добавить 0,5 мл раствора трихлорук­сусной кислоты и далее пробу обработать, как опытную.

Стандартные пробы ставят, как опытные, с той лишь разницей, что вместо сыворотки крови используют раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (основной раствор глюкозы кон­центрации 27,80 ммоль/л для этого разбавляют в 5 раз). В случае констатируемой у обследуемого высокой концентрации глюкозы могут быть использованы промежуточные разведения стандарта (16,65 ммоль/л) или же сам основной раствор.

Стандартные пробы обрабатывают так же, как опыт­ные. Абсорбцию измеряют на ФЭКе с красным или желто-оран­жевым светофильтром (или другом приборе) в кювете с шириной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют дистилли­рованную воду (или контрольную пробу). На основании получен­ных данных строят градуировочную кривую.

Линейная зависимость между величинами абсорбции и концентрации сохраняется в интервале 1,78–22,20 ммоль/л. При бо­лее высокой, чем 22,20 ммоль/л, концентрации глюкозы исход­ный объем анализируемой пробы следует уменьшить в 2 раза, а исследование повторить.

В цельной крови и плазме практически здоровых взрослых людей концентрация глюкозы, определенная данным методом, составляет соответственно 3,32–5,55 ммоль/л и 3,32–6,10 ммоль/л.

Определение глюкозы в моче

Ход работы

Перед проведением исследо­вания ставят качественную пробу на содержание глюкозы в моче и в зависимости от полученного результата мочу разводят в 2–10 раз.

К 0,1 мл подготовленной таким способом мочи добавляют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты и после перемешивания содержимое пробы центрифугируют на общеклинической цен­трифуге (типа ОПН-3) в течение 15 мин при 1500 об/мин. 0,5 мл центрифугата смешивают с 4,5 мл ортотолуидинового реактива и далее пробы обрабатывают так же, как опытные при исследова­нии глюкозы в крови.

При расчете следует учесть соответствующее разведение мочи.

В норме моча содержит следы глюкозы. Для перехода от массовой концентрации (выражаемой размерностью «г/дл») к выражению содержания глюкозы в «ммоль/л» следует воспользо­ваться фактором пересчета (F) 55,5. Этот фактор может быть най­ден по общей формуле:

F = (1 г % • 10) : Mr, или (1 • 10) : 180 = 10 : 180 = 0,0555 моль/л (55,5 ммоль/л),

где Мг – относительная молекулярная масса глюкозы.

То есть 1 г/дл раствора глюкозы соответствует 55,5 ммоль/л.

Лабораторное занятие 3

Обмен липидов

Цель: Изучить определение некоторых компонентов обмена липидов

Реактивы и оборудование: желчь; раствор сахарозы; концентрированная серная кислота; раствор мыла; раствор яичного белка; раствор карбоната натрия; дистиллированная вода; гептан; изопропиловый спирт; серная кислота, 0,04 моль/л (2,2 мл концентрированной серной кислоты доводят до 1 мл дистиллированной водой); раствор гидроксида калия, 6,25 моль/л (17,5 г KOH растворяют в 50 мл дистиллированной воды); прейодатный реактив (0,6 г натрия йоднокислого мета (NaIO₄) вносят в 100 мл раствора уксусной кислоты (50 г/л)); реактив ацетата аммония, 2 моль/л (154 г уксуснокислого аммония растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят его объем до 1 л (pH = 8,6)); ацетилацетоновый реактив (1,5 мл ацетилацетона доливают до 200 мл 2 моль/л раствором ацетата аммония; стандартный раствор триолеина, 2,2 ммоль/л (в мерную колбу на 100 мл вносят 200 г триолеина и доливают изопропиловым спиртом до метки); центрифуга; ФЭК с кюветами шириной 5 мм.

Опыт 1 Качественная реакция на желчные кислоты

Ход работы

В сухую пробирку наливают 10 капель разведенной желчи, добавляют 1–2 капли раствора сахарозы (или фруктозы) и, наклонив пробирку, осторожно (по стенке) наслаивают равный объем концентрированной серной кислоты. На границе слоев образуется пурпурное кольцо, которое затем принимает красно-фиолетовое окрашивание.

Опыт 2 Исследование действия эмульгаторов на жир

Ход работы

В штатив ставят 5 пробирок. В первую из них наливают 20 капель желчи, во вторую – 20 капель раствора мыла, в третью, четвертую и пятую соответственно по 20 капель раствора яичного белка, карбоната натрия и дистиллированной воды. Затем во все пробирки вносят по 3 капли растительного масла, содержимое взбалтывают. Через 5 минут учитывают результаты опыта.

Опыт 3 Определение содержания триацилглицеринов в сыворотке крови колориметрическим методом

Триацилглицерины экстрагирую из сыво­ротки крови. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерол окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся формальдегид дает с ацетилацетоном 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, интенсивность окраски кото­рого пропорциональна содержанию триацилглицеринов.

Ход работы

К 0,5 мл сыворотки крови добавляют 2,0 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1,0 мл раствора серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают в про­должение 20 с, оставляют стоять в течение 5 мин и центрифуги­руют 10 мин (при 3000 об/мин на центрифуге типа ОПН-3).

К 0,4 мл верхнего слоя жидкости приливают 2,0 мл изопропи­лового спирта и 1 каплю раствора КОН. Содержимое пробирки перемешивают на протяжении 15 с. Пробирку закрывают проб­кой и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при 70 °С. Пос­ле ее охлаждения добавляют по 0,2 мл перйодатного и 1,0 мл ацетилацетонового реактивов, содержимое пробирки смешивают, закрывают ее пробкой и вновь нагревают в течение 10 мин на во­дяной бане при 70 °С, после чего измеряют оптическую плотность пробы на ФЭКе с синим (фиолетовым) светофиль­тром (область длин волн 410–430 нм) в кювете с шириной слоя 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контроль­ной пробы.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,5 мл воды.

Стандартную пробу проводят так же, как опытную, но вместо сыворотки используют 0,5 мл калибровочного раство­ра.

Расчет производят по формуле:

С_оп (ммоль/л) = А_оп : А_{ст *} 2,3,

где 2,3 – концентрация триацилглицеринов в стандартном растворе (ммоль/л).

Лабораторное занятие 4

Обмен белков

Цель: Освоить качественные и количественные методы определения белка

Реактивы и оборудование: моча; хлорид натрия; уксусная кислота; сульфаниловая кислота; сыворотка крови; спиртовка; ФЭК; стандартная прямоугольная кварцевая кювета; универсальная индикаторная бумага.

Опыт 1 Качественные реакции на белок в моче

Проба кипячением

Ход работы

В пробирку наливают 2–3 мл профильтрованной исследуемой мочи. Если реакция мочи щелочная, то ее предварительно подкисляют уксусной кислотой до слабо кислой реакции. Добавляют 0,5–1 мл раствора хлорида натрия и нагревают верхнюю часть пробирки. Как только верхний слой жидкости начнет кипеть, прекращают нагревание и добавляют 2–3 капли раствора уксусной кислоты. Появление осадка, не растворяющегося при добавлении кислоты, указывает на присутствие в исследуемой моче белка.

При кипячении мочи, даже имеющей слабокислую реакцию, может выпасть осадок фосфорнокислых солей щелочноземельных металлов. Эти осадки, в отличие от белка, растворимы при добавлении уксусной кислоты.

Проба с сульфосалициловой кислотой

Ход работы

В пробирку наливают 2–3 мл прозрачной слабокислой или кислой мочи и добавляют 5–6 капель раствора сульфосалициловой кислоты. Появление осадка или мути указывает на присутствие белка.

Проба с сульфосалициловой кислотой очень часто применяется в клинике. Она принадлежит к наиболее чувствительным реакциям и открывает белок при содержании до 0,0015 % его в моче.

Опыт 2 Количественное определение белка в

коротковолновом ультрафиолете

Метод базируется на регистрации поглоще­ния белком ультрафиолетового светового потока с последующим установлением на основании этого концентрации общего белка сыворотки (плазмы) крови.

Ход работы

Сыворотку крови разводят изотоническим раствором в 250 раз (для этого 0,1 мл сыворотки крови доводят до 25 мл). Получен­ный раствор вносят в стандартную прямоугольную кварцевую кювету. Оптическую плотность измеряют при длине волны 280 нм (желательно выполнять параллельные исследования). Найден­ную величину умножают на число, показывающее разведение сыворотки. Таким образом рассчитывают концентрацию белка в г/л.

Пример расчета: средняя величина абсорбции для двух параллельно обрабатываемых проб составляет 0,320. Чтобы найти концентрацию белка в г/л, показатель абсорбции 0,320 умножают на 250, получая тем самым значение концентрации белка в размерности «г/л» (в приведенном случае – 80 г/л). В общем виде формула расчета содержания «полного» белка в биологической жидкости имеет вид:

С (г/л) = А • F,

где С – концентрация белка в г/л, А – показатель абсорбции, F – степень разведения.

Лабораторное занятие 5

Основы энергетики

Цель: Обнаружение НАД в дрожжах; сопоставление окислительно-восстановительных потенциалов рибофлавина и индикатора метиленового синего

Реактивы и оборудование: дрожжи; ацетон; гидроксид натрия; фенолфталеин; соляная кислота; рибофлавин; метиленовый синий; цинк; концентрированная соляная кислота; флуориметр.

Опыт 1 Обнаружение НАД в дрожжах

НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, богаты им и дрожжи. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном. Эта реакция характерна для N-производных амида никотиновой кислоты. Она применяется для определения метилникотинамида в моче.

Ход работы

В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4–5 мм добав­ляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20–30 с, не допуская выбрасывания жидкости. Отфильтровывают в пустую пробирку 5–10 капель полученно­го экстракта, добавляют 3–5 капель ацетона и 1–2 капли раствора гидроксида натрия. Оставляют пробирку на 2 мин, затем добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенол­фталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Помес­тить пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, затем охладить и под­нести к включенному флуориметру. Ацетоновый комплекс НАД флуорес­цирует синим светом.

Опыт 2 Сопоставление окислительно-восстановительных потенциалов рибофлавина и индикатора метиленового синего

Для исследования окислительно-восстановительных потенциалов применяются индикаторы, меняющие свой цвет при определенном значении окислительно-восстановительного потенциала. Например, метиленовый синий (синий в окисленном состоянии) превращается в лейкометиленовый синий (бесцветный в восстановленной форме).

Ход работы

В пробирку вносят 4–6 капель воды, 1 каплю взвеси рибофлавина и по каплям метиленовый синий – до синего или зеленовато-синего окрашивания раствора. Внести в пробирку кусочек цинка и 2–3 капли концентрированной соляной кислоты (начинается выделение пузырьков водорода). По мере насыщения раствора водородом окислительно-восстановительный потенциал смеси постепенно снижается и происходит восстановление рибофлавина и метиленового синего. Восстановление всего объема метиленового синего (Ео= +0,11 В) происходит раньше, чем восстановление значительной части внесенного в пробирку рибофлавина (Јg = – 0,20 В), поэтому цвет жидкости переходит последовательно в зеленый, желто-зеленый, желтый, бледно-желтый или розовый и, наконец, жидкость обесцвечивается за счет восстановления рибофлавина в лейкосоединение. Бесцветную или розовую жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением окраски. Водород в жидкость больше не поступает, а уже растворенный в ней уходит в воздух и переносится через рибофлавин и метиленовый синий на кислород воздуха (EQ = 0,82 В). В результате происходит постепенное повышение окислительно-восстановительного потенциала, после расходования в растворе водорода начинается окисление восстановленного рибофлавина. Он передает водород через индикатор метиленовый синий на кислород и желтеет (часть водорода поступает к кислороду, минуя индикатор). После этого начинается окисление лейкометиленового синего – раствор становится сначала зеленым (желтый и синий цвет дают зеленый) и затем цвет восстанавливается.

Лабораторное занятие 6

Определение общего белка в биологическом материале

Цель: Определить общий белок в сыворотке крови.

Реактивы и оборудование: сыворотка крови; дистиллированная вода; спирт; рефрактометр; фильтровальная бумага.

Опыт 1 Рефрактометрическое определение общего белка сыворотки крови

В основе рефрактометрии лежит способность сред по-разному преломлять проходящие через них лучи света. Луч света, переходя их одной среды в другую, меняет направление (преломляется). Отношение синуса угла падения к синусу угла преломления носит название показателя (коэф­фициента) преломления. Степень рефракции раствора обусловлена коли­чеством, величиной, физическим состоянием растворенных в нем частиц и температурой внешней среды. В биологических жидкостях (сыворотка крови и пр.) величина рефракции зависит в первую очередь от количества и качества белков (солям и другим составным частям принадлежит мень­шая роль). Определение коэффициента преломления производится в спе­циальных приборах – рефрактометрах.

Перед началом работы на рефрактометре устанавливается нулевая точка прибора. Для этого на полированную поверхность измерительной призмы рефрактометра наносят 1–2 капли дистиллированной воды, закрывают камеру и линию лупы шкалы устанавливают на делении 1,333. Границу светотени подводят ключом до точки пересечения визирных линий. После этого фильтровальной бумагой удаляют остатки воды, а на поверхность призмы наносят 1–2 капли сыворотки крови (без гемолиза). Камеру закрывают и устанавливают границу светотени на точке пересечения визирных линий. По шкале производят отсчет показателя рефракции и по таблице определяют содержание белка в сыворотке крови.

Таблица 1 – Содержание общего белка сыворотки крови

в зависимости от коэффициента рефракции

Показания рефрактометра	Белок г/100 мл г (%)	Показания рефрактометра		Белок г/100 мл г (%)	Показания рефрактометра	Белок г/100 мл г (%)
1,3442	4,76	1,3472		6,55	1,3502	8,32
1,3443	4,82	1,3473		6,61	1,3503	8,36
1,3444	4,88	1,3474		6,67	1,3504	8,42
1,3445	4,94	1,3475		6,73	1,3505	8,46
1,3446	5,00	1,3476		6,79	1,3506	8,52
1,3447	5,06	1,3477		6,85	1,3507	8,58
1,3448	5,12	1,3478		6,91	1,3508	8,64
1,3449	5,18	1,3479		6,98	1,3509	8,70
1,3450	5,24	1,3480		7,04	1,3510	8,76
1,3451	5,30	1,3481		7,10	1,3511	8,82
1,3452	5,36	1,3482		7,16	1,3512	8,88
1,3453	5,42	1,3483		7,22	1,3513	8,94
1,3454	5,48	1,3484		7,28	1,3514	9,00
1,3455	5,54	1,3485		7,34	1,3515	9,06
1,3456	5,60	1,3486		7,40	1,3516	9,12
1,3457	5,66	1,3487		7,46	1,3517	9,18
1,3458	5,71	1,3488		7,52	1,3518	9,24
1,3459	5,77	1,3489		7,58	1,3519	9,30
1,3460	5,83	1,3490		7,64	1,3520	9,36
1,3461	5,89	1,3491		7,70	1,3521	9,42
1,3462	5,95	1,3492		7,76	1,3522	9,47
1,3463	6,01	1,3493		7,82	1,3523	9,52
1,3464	6,07	1,3494		7,87	1,3524	9,58
1,3465	6,13	1,3495		7,92	1,3525	9,64
1,3466	6,19	1,3496		7,98	1,3526	9,70
1,3467	6,25	1,3497		8,04	1,3527	9,76
1,3468	6,31	1,3498		8,10	1,3528	9,82
1,3469	6,37	1,3499		8,16	1,3529	9,87
1,3470	6,43	1,3500		8,21	1,3530	9,92
1,3471	6,49		1,3501	8,26	1,3531	9,98

Тесты

Тест 1 Обмен углеводов

1 а) Что называется процессом гликолиза? б) Напишите суммарное уравнение гликолиза.

2 а) Напишите уравнение реакции образования глюкозо-6-фосфата при гликолизе; б) Какие ферменты принимают участие в этой реакции?

3 а) Напишите уравнение реакции образования глюкозо-1,6-дифос-фата при гликолизе; б) Какие ферменты принимают участие в этой реакции?

4 а) Напишите уравнение реакции образования глицеральдегид-3-фосфата при гликолизе; б) Какие ферменты принимают участие в этой реакции?

5 а) Напишите уравнение реакции образования 3-фосфоглицерата при гликолизе; б) Какие ферменты принимают участие в этой реакции?

6 а) Напишите уравнение реакции образования в процессе гликолиза лактата из 3-фосфоглицерат; б) Какие ферменты принимают участие в этой реакции?

7 Какие реакции гликолиза связаны с процессом окислительного фосфорилирования?

8 Какой фермент принимает участие в превращении 2-фосфогли-церата в 2-фосфоенолпируват: а) триозофосфатизомераза; б) енолаза; в) пируваткиназа; г) D-глицеральдегидфосфатдегидрогеназа; д) фосфофруктокиназа?

9 Что является конечным продуктом гликолиза: а) пируват; б) лактат; в) пируват и лактат; г) этанол и CO₂; д) пропионат?

10 Каким процессом сопровождается дегидратация 2-фосфоглицерата: а) ингибированием ионами Са; б) активированием ионами фтора; в) повышением энергетического уровня фосфатной связи в 2-фосфо-енолпирувате за счет внутримолекулярного окисления-восстановления; г) активированием фосфофруктокиназой?

11 Какое количество макроэргических связей образуется при окислении молекулы D-глюкозы до лактата: а) три; б) четыре; в) две; г) шесть?

12 Какое количество макроэргических связей образуется при полном оки-слении молекулы D-галактозы до СО₂ и Н₂О: а) 12; б) 24; в) 30; г) 36; д) 38?

13 Какое количество макроэргических связей образуется при полном окислении фруктозо-6-фосфата: а) 24; б) 36; в) 12; г) 38; д) 39?

14 Какое количество макроэргических связей образуется при полном окислении глицерол-3-фосфата: а) 5; б) 20; в) 12; г) 25?

15. В результате какой реакции образуется седогептулозо-7-фосфат и D-глицеральдегид-3-фосфат из рибозо-5-фосфата и ксилулозо-5-фосфата: а) трансаминирования; б) трансгликозилирования; в) трансальдолазной; г) транскетолазной; д) трансфосфорилирования?

16 Какое количество молей АТФ образуется при полном окисле­нии сахарозы: а) 38; б) 70; в) 76; г) 100?

17 На каком этапе превращения в цикле Кребса синтезируется ГТФ: а) цитрата в цисаконитат; б) а-кетоглутарата в сукцинат; в) сукцината в фумарат; г) малата в оксалоацетат?

18. На каких этапах превращения цикла Кребса происходят реакции дегидрирования: а) цитрата в цисаконитат; б) цитрата в изоцитрат; в) окисления а-кетоглутарата; г) малата в оксалоацетат; д) сукцината в фумарат; е) фумарата в малат; ж) изоцитрата в α-кетоглутарат. Каково количество этих реакций: а) четыре; б) пять?

19 Определите основное назначение пентозофосфатного пути: а) окисление глюкозы; б) генерация в цитоплазме НАДФН₂, снабжение тканей пентозами для синтеза нуклеиновых кислот, участие в образовании глюкозы из CO₂ в темновой реакции фотосинтеза; в) снабжение субстратом для глюконеогенеза; г) обеспечение ацетил-SKoA для биосинтеза жирных кислот и стеролов; д) образование лактата?

20. Какой из перечисленных ферментов катализирует реакцию биосинтеза гликогена: а) α-1,6-глюкозидаза; б)гликогенфосфорилаза; в) гликогенсинтаза; г) гликогенфосфорилаза и фосфоглюкомутаза ?

Тест 2 Обмен липидов

1. В результате действия каких ферментов образуются свобод­ные жирные кислоты: а) фосфолипаз; б) ацетилхолинэстеразы; в) неспецифической эстеразы; г) липазы; д) алиэстеразы?

2. Какому превращению подвергается глицерол, возникший при распаде триацилглицеролов на первом этапе: а) восстановлению; б) окислению; в) метилированию; г) фосфорилированию; д) ацилированию?

3 По какому пути идет (преимущественно) распад высших жирных кислот: а) декарбоксилирования; б) восстановления; в) w -окисления; г) β-окисления; д) α-окисления?

4 В каких клеточных компонентах происходит окисление жир­ных кислот: а) ядре; б) митохондрии; в) рибосомах; г) микросомах; д) цитоплазме?

5 Какие стадии содержит процесс активации молекул жирных кислот и проникновения их из цитоплазмы внутрь митохондрий: а) ферментативная этерификация свободной жирной кислоты цитоплазматическим КоА (за счет АТФ), которая происходит в наруж­ной мембране митохондрий; б) фосфорилирование свободной жирной кислоты за счет АТФ; в) перенос остатка жирной кислоты на молеку­лу карнитина, с помощью которого осуществляется перенос этого остатка через внутреннюю мембрану митохондрий; г) перенос остат­ка жирной кислоты от КоА на молекулу креатина; д) перенос остат­ка жирной кислоты на внутримитохондриальный КоА?

6 Какое низкомолекулярное азотистое основание принимает участие в переносе остатка жирной кислоты через мембрану мито­хондрий: а) карнозин; б) карнитин; в) креатинин; г) анзерин?

7 Как называются ферменты, катализирующие образование КоА-эфиров жирных кислот: а) ацилтрансфераза; б) ацетил-КоА-синтетаза; в) тиокиназа жирных кислот; г) ацил-КоА-дегидрогеназа, д)β-кетотиолаза?

8. Какие реакции входят в цикл β-окисления жирных кислот: а) ак­тивация жирных кислот за счет KoA-SH (с участием АТФ); б) декарбо-ксилирование; в) дегидрирование; г) дегидратация; д) гидратация?

9. Как называется фермент, с помощью которого отщепляются два углеродных радикала от β-кетоацил-КоА: а) тиокиназа; б) ацилтрансфераза; в) β-кетотиолаза; г) ацил-КоА-дегидрогеназа; д) гидроксиацил-КоА-гидро-лиаза?

10 Какие соединения называются кетоновыми (ацетоновыми) телами: а) ацетоацетил-КоА; б) ацетоацетат; в) гидроксибутират; г) ацетон; д) сукцинат?

11 Напишите суммарные уравнения для следующих метаболиче­ских процессов, включая все необходимые стадии, требующие акти­вации, а также стадии окислительного фосфорилирования (считайте, что реакции протекают в клетках печени, почек или сердца): а) окис­ление пальмитиновой кислоты до ацетоацетата; б) окисление арахидоновой кислоты до CO₂ и H₂O; в) окисление β-гидроксибутирата до CO₂ и H₂O; г) окисление пропионата до CO₂ и H₂O; д) окисление миристиновой кислоты до ацетил-КоА.

12 Какие конечные продукты образуются в результате β-окисления жирных кислот с нечетным числом атомов углерода: а) сукцинил-КоА; б) пропионил-КоА; в) ацетил-КоА; г) метилмалонил-КоА; д) β-гидроксибутират?

13 Какие пути окисления жирных кислот, кроме β-окисления, происходят в живых клетках: а) окислительное фосфорилирование; б) α-окисление; в) w-окисление?

14 Какое соединение является продуктом первой реакции β-окисления жирных кислот: а) ацетил-КоА; б) ацил-КоА; в) ацето­ацетат; г) сукцинил-КоА; д) глицерофосфат?

15 Какое соединение является конечным продуктом распада высших жирных кислот: а) α-глицеролфосфат; б) β-гидроксибутират; в) ацетил-КоА; г) метилмалонил-КоА; д) ацил-КоА?

16 Напишите уравнение реакции окисления стеариновой кисло­ты по α-углеродному атому; назовите ферменты, катализирующие данный процесс.

17 Напишите уравнения первых двух реакций преобразования линолевой кислоты перед началом ее β-окисления. Назовите фер­менты, катализирующие эти реакции.

18 Какие коферменты принимают участие в одном цикле β-окисления жирных кислот: a) KoA-SH; б) ФАД; в) НАД+; г) кобаламин; д) тиаминпирофосфат?

19 Сколько молекул АТФ образуется при отщеплении молекулы ацетил-КоА в результате р-окисления жирных кислот: а) 3; б) 5; в) 35; г) 96; д) 130?

20 Сколько молекул ацетил-Ко А образуется в результате β-окисления стеариновой кислоты: а) 8; б) 3; в) 9; г) 10; д) 7?

Тест 3 Обмен белков

1 Под влиянием каких ферментов происходит расщепление бел­ков в желудке: а) пепсиногена; б) трипсина; в) пепсина; г) энтерокиназы; д) химозина? Опишите механизм действия этих ферментов.

2 Какие ферменты расщепляют белки до полипептидов в кишечни­ке: а) трипсиноген; б) трипсин; в) карбоксипептидаза; д) химотрипсиноген? Укажите особенности действия соответствующих ферментов.

3. Какой путь дезаминирования аминокислот характерен для млекопитающих: а) внутримолекулярный; б) окислительный; в) гид­ролитический; г) восстановительный? Напишите уравнение реакции. Назовите ферменты.

4. Какие кислоты образуются при восстановительном пути дезаминирования аминокислот: а) α-гидроксикислоты; б) предельные кислоты; в) непредельные кислоты; г) α-кетокислоты? Напишите схематическое уравнение реакции.

5. Какие продукты образуются при трансаминировании между α-кетс-глутаратом и аланином: а) аспартат и лактат; б) глутамат и лактат; в) глутамат и пируват; г) глутамин и аспарагин? Напишите уравнение реакции.

6. Назовите кислоты, образующиеся в результате внутримолеку­лярного дезаминирования: а) предельные кислоты; б) гидроксикислоты; в) кетокислоты; г) непредельные кислоты. Напишите уравне­ние внутримолекулярного дезаминирования аланина.

7. Какие аминокислоты являются акцепторами аммиака в мо­мент его образования в клетке; а) аланин; б) глутамат; в) глицин; г) аспартат? Напишите уравнения реакций. Назовите ферменты.

8. Какие аминокислоты или их производные являются источ­ником легко мобилизуемого азота: а) глутамат; б) аспарагин; в) трео­нин; г) глутамин; д) аспартат? Напишите формулы этих соединений.

9. Какая аминокислота является промежуточным продуктом при биосинтезе мочевины и расщепляется с образованием орнитина и мочевины: а) лейцин; б) цитруллин; в) аргинин; д) валин? Напи­шите уравнения всех реакций образования мочевины.

10. Какое соединение является конечным продуктом азотистого обмена у птиц: а) креатин; б) мочевина, NH₃ и мочевая кислота; в) мочевая кислота?

11. Назовите главный конечный продукт азотистого обмена у млекопитающих: а) мочевая кислота; б) мочевина; в) мочевина и аммиак.

12 Реакция трансаминирования является одной из стадий био­синтеза различных соединений. Укажите, каких именно: а) подав­ляющего большинства аминокислот; б) дикарбоновых кислот; в) за­менимых аминокислот?

13 Какие соединения являются промежуточными продуктами биосинтеза мочевины у млекопитающих: а) карбамоилфосфат; б) цит­руллин и орнитин; в) аспартат; г) аргинин; д) глутамат?

14 С какими структурными компонентами клетки связан био­синтез белка: а) ядрами; б) лизосомами; в) аппаратом Гольджи; г) хромосомами; д) рибосомами?

15 Как называется линейно упорядоченная совокупность нуклеотидов, контролирующих синтез функционально связанных друг с другом белков: а) кодоном; б) антикодоном; в) цистроном; г) опероном?

16 Как происходит образование аминоацил-тРНК: а) при взаи­модействии тРНК с аминоациладенилатами; б) тРНКсаминоацилфосфатами; в) тРНК с аминоацил-КоА? Напишите уравнение реакции, назовите фермент.

17 Какие компоненты необходимы для осуществления начальной стадии – активации аминокислот – полипептидного синтеза: а) 20 аминокислот, 20 аминоацил-тРНК-синтетаз, 20 или больше тРНК, АТФ, Mg²+; б) 20 аминокислот, 20 тРНК, ГТФ, Са²⁺; в) 20 амино­кислот, 20 или больше тРНК-синтетаз,Mg²+; г) 20 аминокислот, 20 аминоациладенилатов, Mg²+; д) 20 аминокислот, 20 аминоацилтРНК-синтетаз, АТФ?

18 Сколько различных трипептидов можно синтезировать из аминокислот глицина, валина и серина, если использовать каждую аминокислоту только 1 раз?

19 Сколько различных трипептидов можно синтезировать из аминокислот лизина, аланина и гистидина при условии, что любая из них может занимать любое положение и каждую аминокислоту можно использовать более одного раза?

20 Сколько аминокислотных остатков содержится в молекуле белка молекулярной массой 69 000?

Литература

1. Проскурина, И. К. Биохимия : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И. К. Проскурина. – М. : ВЛАДОС-ПРЕСС, 2003. – 240 с.

2. Биологическая химия : учебник / Т. Т. Березов [и др.]. – М. : Медицина, 1998. – 704 с.

3. Основы биохимии : учебник в 3 т. / А. Уайт [и др.]. – М. : Мир, 1981.

Т. 1 – Мир, 1981. − 534 с.

Т. 2 – Мир, 1981. – 617 с.

Т. 3 – Мир, 1981. – 726 с.

4 Белясова, Н. А. Биохимия и молекулярная биология : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / Н. А. Белясова. – Мн. : Книжный Дом, 2004. – 416 с.

5. Шапиро, Д. К. Практикум по биологической химии : практикум / Д. К. Шапиро. – Мн. : Вышэйшая школа, 1972. – 256 с.

6. Комов, В. П. Биохимия : учеб. для вузов / В. П. Комов, В. Н. Шведова. – 3-е изд., стереотипное. – М. : Дрофа, 2008. – 640 с.

Учебное издание

БЕЛЯЕВА Людмила Александровна

КОРЫТКО Ольга Викторовна