4. Методы люминисцентного анализа

Для люминесцентного анализа втовароведении используется как само по себе наблюдение и сравнение с эталонами, наблюдение с помощью очков-светофильтров или простейших приборов визуализации с вмонтированным сфетофильтром, так и в различные методы люминесцентного анализа: люминесцентная микросокпия (ее можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной), флуориметрия, проточная флуориметрия, спектрально-люминесцентный анализ, хеми - и триболюминесценции.

В методах люминесцентного анализа применяются различные приемы выявления и изучения люминесценции: наблюдение собственной люминесценции, люминесценции индикаторов, флуоресценции-красителей окрашивающих продукт, сенсибилизированной флуоресценции. Каждый из этих приемов имеет свои особенности и может быть применен при соблюдении определенных условий. Для люминесцентного анализа применяются как узкоспециализированные, так и универсальные оптические приборы и установки.

Принципиальное устройство любой установки для люминесцентного анализа показано на схеме (рис.2).

Рис 2 Схема установки для люминесцентного анализа: 1 –источник возбуждения ; 2 – светофильтр или монохроматор; 3 – исследуемый образец; 4 – приемник люминесценции; 5– усилитель; 6 –измерительный прибор или (окуляр микроскопа или глаз )

Один из самых распространненых методов регистарции люминисценции –люминисцентная микроскопия.

Выполняется с помощью устройства –люминесцентного микроскопа

Принцип работы люминисцентного микроскопа основан на некорых физ. законах. Один из них - закон Стокса, согласно к-рому, длина волны света, излучаемого при люминесценции, всегда больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию.

В люминисцентном м. коротковолновое световое (ультрафиолетовое, сине-фиолетовое) излучение, возбуждающее люминесценцию, выделяется возбуждающим светофильтром, помещенным перед осветителем микроскопа.

Лучи света от сильного источника (света) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого излучения, вещество, в зависимости от собственных особенностей или в силу окраски флюорохромами, начинает светиться красным или зеленым светом.

Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи.

В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне будет видно вещество или его структуры, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. (Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки будет светиться ярко-зеленым цветом а лизосомы и РНК - ярко оранжевым.

Устройство люминесцентного микроскопа

Люминесцентный микроскоп устроен также как и оптический.

Но вместо дневного света он имеет мощный источник света, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, систему светофильтров, а также интерференционную светоделительную пластинку (или набор таких пластинок), применяемую при возбуждении люминесценции падающим светом.

1. В качестве источника для возбуждения люминесценции (получения ультрафиолетовых лучей) наиболее часто используются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-гало-генные лампы накаливания, работающих от сети (пусковой ток 6,2 а, рабочий ток–3,6 а). Ртутный пар лампы излучает ряд светосильных линий, которые отстоят друг от друга относительно далеко, так что между ними могут беспрепятственно выделяться флуоресцентные полосы.

Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами – лазерами, излучение к-рых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.

2. Применяют специальные фильтры, изолирующие ультрафиолетовые лучи определенной длины волны Светофильтры изолируют из ультрафиолетовой области лучи с длиной волн между 4000—3200 А, причем максимум пропускания соответствует длинам волн около 3600 А

Фильтры для люминесцентного анализа готовятся из силикатного стекла с примесью окисей никеля и кобальта (черное стекло).

3. Интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции.

Методика исследования не сложна и заключается в том, что испытуемый объект помещают в наблюдательное пространство, зажигают лампу и наблюдают, появится ли люминесценция. Если люминесценция появляется, то отмечают характер ее, цвет, интенсивность, однородность.

4. Флуориметрический (или количественный флуоресцентный) анализ основан на выявлении зависимости между интенсивностью флуоресценции и концентрацией люминесцирующего вещества. Эти методы применимы в тех случаях, когда способностью к люминесценции обладает только определяемое вещество. В противном случае определению должны предшествовать операции по выделению и очистке определяемого вещества или маскированию примесей специальными реагентами.

Флуориметры (фотометры, флуорометры) – приборы для измерения интегральной интенсивности люминесценции, у которых для монохроматизации возбуждения или эмиссий/применяются светофильтры. Они могут быть построены как по однолучевой, так и по двулучевой оптической схеме. Конструктивно двулучевые флуориметры близки к фотоэлектроколориметрам и фотометрам.

Принцип работы флуориметров основан на сравнении интенсивности свечения исследуемого образца и эталона, у которого спектральный состав излучения одинаков или очень близок к излучению образца. Для выделения нужных участков спектра возбуждения и люминесценции используются светофильтры (абсорбционные или интерференционные).

Особенностью работы на флуориметрах является необходимость точного учета размеров излучающей поверхности образца и эталона. Для этой цели в конструкциях приборов предусматриваются щелевые, ирисовые диафрагмы или другие устройства.

Проточная цитофлюориметрия

Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюорнметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование – окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.

5. Спектрально-люминесцентный анализ основан на анализе спектра продукта и определении количественного вклада в него каждого компонента.

Спектральный анализ это в первую очередь качественный анализ.

Преимущество спектрального анализа перед флуориметрическим состоит в возможности одновременного определения сразу нескольких компонентов.

Для измерения спектральных характеристик люминесценции используются спектрофлуориметры и спектрофотометры.

Спектрофлуориметры – приборы, регистрирующие спектры люминесценции и спектры возбуждения, в которых вместо светофильтров используются монохроматоры. Оптической схемой и конструктивно они близки к спектрофотометрам. В отличие от флуориметров необходимые участки спектров выделяются монохроматорами.

рис 3. Схема спектральной установки для изучения собственнйо люминисценции пищевых продуктов

1- источник возбуждения; 2,4,6 – кварцевые конденсоры; 3,10-дифракционные монохроматоры4 5–поляризатор; 6- вакуумный кріостат; 7- исследуемый образец;9– аналізатор; 11- приемник люминисценции ; 12- усилитель; 13- регистрирующий прибор.

Благодаря применению высокочувствительной спектральных установок с вакуумным криостатом для образцов многих пищевых продуктов были получены спектры собственной люминесценции, позволяющие достаточно надежно идентифицировать основные компоненты этих продуктов: белки, жиры, витамины, кислоты.