Использование клеточных культур

Культуры клеток – это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам.

Для выращивания клеточных культур необходимы среды, которые должны иметь солевой состав, близкий клеткам организма, определенное значение pH, содержать питательные вещества и факторы роста. Первые питательные среды состояли из плазмы, сыворотки крови, эмбрионального экстракта и др. Эти биологические компоненты используют и в настоящее время. Основой всех современных сред являются сбалансированные солевые растворы Хэнкса и Эрла. Питательные среды для культур клеток разделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды в отличии от поддерживающих содержат сыворотку крови.

Питательные среды по происхождению делят на естественные и искусственные. Естественные – это ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов (гидролизат лактальбумина, казеина, гемогидролизат и др.). Синтетические среды получают добавлением к солевым растворам аминокислот, витаминов (среда 199, среда Игла).

В диагностической работе вирусологических лабораторий широко применяются следующие клеточные культуры: первично-трипсинизированные, перевиваемые и полуперевиваемые.

Если первичную ткань пересевают в свежую питательную среду (т.е. производят пассаж) и в ней образуется рост культуры, т.е её называют тканевой субкультурой. Практически субкультуры удаётся получить из любой первичной ткани, но количество пассажей ткань выдерживает не больше 4-5, редко до 20. В результате подбора специальных питательных сред, режима пассажирования удается адаптировать отдельные ткани к определенной питательной среде и пассажировать их (перевивать) очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассажированию называются перевиваемыми.

Первично-трипсинизированные культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – это растущие однослойные культуры клеток, полученные посредством ферментативной дезагрегации органов и тканей. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

Недостатком первично-трипсинизированных культур является трудоемкость и длительность их получения, а также частая контаминация латентными вирусами. Выбор органа и ткани зависит от чувствительности их клеток in vitro к исследуемому материалу. В вирусологической практике нашли применение первично-трипсинизированные культуры фибробластов мышей, эмбрионов человека, эмбрионов кур, почек морской свинки.

Перевиваемые культуры клеток.

Перевиваемые культуры клеток получают из необластических и нормальных тканей и органов человека или животных. Они имеют измененный кариотип и обладают способностью бесконечно перевиваться in vitro.

Перевиваемые культуры клеток в сравнении с первично-трипсинизированными обладают существенными преимуществами: способностью неопределённо долгое время перевиваться, высокой интенсивностью размножения, простой техникой культивирования, возможностью использования сходных штаммов в различных лабораториях, отсутствием инфицированности посторонними вирусами. Многие перевиваемые культуры проведены через сотни серийных пассажей, имеют совершенно одинаковую форму клеток, стабильны в условиях in vitro, что делает их особенно пригодными для выполнения различных экспериментальных исследований. Перевиваемые культуры клеток Hela, Hep-1, Hep-2, почка эмбриона свиньи, почка эмбриона коровы и другие используются для выделения вируса из патологического материала. Перевиваемые культуры выращивают в виде суспензии или однослойных культур на поверхности стекла в культурных сосудах.

Перевиваемые клетки легче получать из злокачественных тканей (клетки Hela получены из карциномы шейки матки женщины, клетки Hep-2 из карциномы гортани человека идр.), но в настоящее время широко культивируются перевиваемые клетки «нормальных» тканей. Однако существует мнение, что перевиваемые ткани «нормального» происхождения вследствие приобретённой потенциальной возможности к бесконечному размножению перерождаеются.

В вирусологической практике перевиваемые ткани имеют некоторые преимущества: они свободны от скрытых вирусов, тогда, как первичные ткани могут быть носителями латентного вируса; обладают более широким спектром чувствительности к разным вирусам; кроме того, детально изучена их морфология и чувствительность к различным вирусам.

Но перевиваемые клетки имеют ряд недостатков, которые ограничивают в известной степени их применение: они склонны к малигнизации, т.е. к злокачественному перерождению независимо от их происхождения; необходимость постоянного поддержания их; у них появляется неспецифическая дегенерация, изменяется морфология клеток и снижается чувствительность к вирусам. В последние годы в вирусологии, особенно в биопромышленности, применяют штаммы клеток с диплоидным набором хромосом, так называемые диплоидные клетки. Такие штаммы клеток сохраняют хромосомный набор, типичный для исходных тканей. Диплоидные клетки обладают чувствительностью к вирусам, как исходные клетки, свободны от латентных вирусов и не обладают канцерогенными свойствами. Недостаток диплоидных клеток – ограниченная возможность их пассажирования.

Получение субкультур или перевивание клеток проводят следующим образом.

Снятие клеточного слоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путём (соскоб), или воздействием 0,02% раствора версена, или 0,25% раствором трипсина.

Из сосудов с выросшим клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют в них подогретый до 37С раствор версена (в количестве вдвое меньшем, чем было среды) и выдерживают в термостате 20-30 минут, при этом сосуд несколько раз покачивают. Версен связывает двухвалентные катионы магния и кальция, в результате ткань разделяется на отдельные клетки и отслаивается от стекла.

Отделение клеток от диспергирующего вещества. Взвесь клеток в диспрегирующем веществе (в версене) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800-1000об/мин в течение 7-10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Затем берут 1-2 мл клеточной взвеси и подсчитывают клетки.

Посев клеток. После подсчёта клеток в 1 мл исходную клеточную взвесь разводят питательной средой до нужной концентрации. При этом учитывают добавление к общему объему среды стерильной сыворотки крупного рогатого скота в количестве 10%. Подготовленную взвесь вносят при помешивании в специально подготовленную для культивирования клеток посуду и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток в пробирке по 80-100 тыс. в 1 мл; в сосуды с плоской поверхностью – 25-30 тыс. на 1 см полезной площади сосуда.

Засеянные клетки выращивают в термостате при температуре 37С в течение 3-4 суток.

Перевиваемые штаммы клеток обычно пересеваются через каждые 6-7 дней.

Заражение клеточных культур вирусом. Проводят в стерильном боксе. Перед заражением все клеточные культуры микроскопируют и отбирают пробирки или матрацы только с хорошим, типичным монослоем. Культуры с неполным монослоем, с признаками дегенерации клеток или с нетипичным клеточным ростом бракуют.

В качестве вируссодержащего материала для заражения клеток используют фильтраты (прошедшие через бактерийный фильтр) или свежевзятый (в стерильных условиях) нативный материал с добавлением антибиотиков. Заражать ткани можно пассажным вирусом на культуре ткани. В этом случае используют от культур с типичным для данного вируса цитопатогенным эффектом.

Методика заражения. Из отобранных культур отсасывают или сливают питательную среду. Часть культур (не менее четырёх) оставляют в качестве контроля; в них вносят по 0,1 мл свежей питательной среды без сыворотки. В другие 4-6 пробирок с клеточным монослоем вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала. Все культуры в пробирках (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37С 20-30 минут. Затем в них добавляют по 0,9 мл питательной среды без сыворотки, ставят в термостат и ежедневно наблюдают за ними, сравнивая под микроскопом опытные культуры клеток с контрольными.

Необходимо иметь в виду, что при внесении вируса и при последующем его выращивании пробирки выдерживают в термостате под углом так, чтобы клеточный слой был покрыт питательной средой. Поэтому на пробирках принято делать продольные прямые линии цветным карандашом. Пробирки укладывают всегда линией вверх.

Учёт результатов заражения. В контрольных культурах клеток обычно в течение недели морфологических изменения не отмечают. В опытных культурах под воздействием вируса видимые изменения в клетках могут наступить уже через 10-12 часов, или через несколько дней, или заметной деструкции клеток не наступит. Всё это зависит от восприимчивости ткани к данному вирусу, свойств и дозы вируса, условий культивирования и т.д. Кроме того, следует учитывать также, что морфологические клетки могут изменяться под воздействием токсических веществ, содержавшихся в исследуемом материале.

Чтобы убедиться в отсутствии действии вируса на клетки или подтвердить специфичность этого действия , а также убедиться в том, что наступившая дегенерация клеток не является результатом действия токсических веществ, из зараженных тканей отсасывают культуральную жидкость и заражают ею свежую культуру ткани, т.е. проводят пассаж. Повторение морфологических изменений в пассажах указывает на наличие и размножение вируса. Если в первом дегенерация клеток наступила, а в пассаже она отсутствует, то предполагают наличие в материале токсических веществ.

Отсутствие каких-либо видимых изменений в клетках в первом заражении и пассажах окончательно не исключает наличие вируса в исследуемом материале, т.к. некоторые вирусы не способны вызывать деструкции клеток.