Полуперевиваемые культуры клеток.
Полуперевиваемые культуры клеток – это культуры диплоидных клеток человека и животных. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами (стабилизации, активного роста, старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).
Культуры диплоидных клеток получают из тканей человека путем серийных пассажей культур клеток, сохраняющих характерную диплоидную конфигурацию хромосом. Преимущество культур диплоидных клеток состоит в высокой чувствительности к различным вирусам.
Индикация вирусов
Обнаружение вируса в культуре клеток называется индикацией и осуществляется следующими методами:
Выявлением специфической дегенерации клеток (ЦПД – цитопатогенное действие вируса);
Обнаружением внутриклеточных включений;
Под электронным микроскопом;
По образованию бляшек;
По положительной реакции гемагглютинации;
По положительной реакции гемадсорбции;
По подавлению метаболизма клеток (реакция цветной пробы).
Цитопатогенное действие вируса.
Простейшим признаком, свидетельствующим о размножении вируса, являются дегенеративные изменения в клетках, то есть проявление цитопатогенного действия вируса. Наступившие видимые морфологические изменения в клетке называют цитопатогенным эффектом.
Цитопатические изменения в инфицированных культурах клеток зависят от биологических свойств и дозы исследуемого вируса. Одни вирусы проявляют ЦПД в течение первой недели после заражения (вирус полиомиелита, Коксаки В), другие – спустя 1-2 недели после заражения (аденовирусы).
Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа (рис. 1).
Характер изменений при инфицировании клеточных культур классифицируется на следующие группы:
Очаговое мелкозернистое перерождение;
Мелкозернистое перерождение по всему монослою;
Очаговое гроздевидное скопление клеток;
Равномерная зернистость клеток;
Объединение клеток в гигантские многоядерные клетки и симпласты.
Рисунок 1. Цитопатогенное действие вируса.
Обнаружение внутриклеточных включений.
При репродукции некоторых вирусов внутри протоплазмы или ядра клетки образуются специфические включения. Для их обнаружения культуры клеток выращивают на специальных стеклянных пластинках, помещенных в стерильные пробирки с 2 мл клеточной суспензии. После образования монослоя клетки заражают вирусом и через определенные сроки в зависимости от свойств исследуемого вируса готовят препараты. Для морфологических исследований культуры клеток окрашивают обычными красителями (рис.2).
Рисунок 2. Включения в цитоплазме клеток.
Обнаружение вирусов с помощью электронного микроскопа.
В большинстве клеток, зараженных вирусом, под электронным микроскопом различают кристаллоподобные структуры с полигональным неупорядоченным содержимым. Именно в этих местах происходит репродукция вирусов, накопление созревших вирионов (рис.3).
Рисунок 3. Электронная микроскопия вируса герпеса.