II. Цито- и гистохимические методы исследования

Цито- и гистохимические методы позволяют выявлять химические соединения различных классов в структурах клеток и тканей, а также их локализацию. Специфичность химической реакции в ряде случаев может быть проверена с помощью дополнительного контроля (например, путем предварительного расщепления соответствующим ферментом).

В основу цито- и гистохимических методов исследования положен ряд принципов.

1. Избирательное окрашивание, при котором определенные химические группировки внутриклеточного вещества вступают в реакцию с красителем.

2. Избирательное растворение красителя в определенном субстрате, характеризующем клеточную структуру.

3. Перевод некоторых неактивных химических соединений, неспособных взаимодействовать с красителем, в активное состояние.

4. Получение с помощью промежуточных реакций неокрашенного продукта с последующим переводом его в окрашенный.

Так, специфичной для выявления ДНК является реакция Фельгена, которая основана на том, что альдегидные группы дезоксирибозы восстанавливают окраску основного фуксина, предварительно обесцвеченного сернистой кислотой (реактив Шиффа). В результате реакции хроматин окрашивается в пурпурно-красный цвет. Для одновременного выявления ДНК и РНК часто применяют метод Браше с использованием метилового зеленого и пиронина. При этом способе метиловый зеленый окрашивает ДНК хромосом в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет.

Выявление гликогена, гликопротеинов, гликолипидов – соединений, содержащих сахара, основано на окислении гликолевых групп последних до альдегидов с последующим взаимодействием с реактивом Шиффа. продукт реакции окрашивается в различные оттенки пурпурно-красного цвета. В случае выявления гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, гепарин) используют способность их анионных групп связываться при низких значениях рН с основными красителями или давать метахроматическое окрашивание с тиазиновыми красителями - толуидиновым синим, азуром.

Выявление липидов основывается на их способности окрашиваться растворенными в них красителями, например суданом. Сочетание цито- и гистохимических методов исследования с методом электронной микроскопии послужило основой развития электронной гистохимии.

III. Приготовление препаратов (объектов) для прижизненного изучения клеток и тканей

Объектами прижизненного изучения могут служить тонкие тканевые пленки (брыжейка, плавательная перепонка лягушки), клетки крови, клетки в культуре тканей и др. При суправитальном исследовании клетки помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора или специальной питательной среды, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом.

Прижизненные исследования требуют применения специальных методик микроскопирования без использования красителей: фазовоконтрастная, темнопольная, поляризационная, люминесцентная, ультрафиолетовая микроскопия. Примером суправитального окрашивания моежт служить окрашивание бриллианткрезиловым синим ретикулоцитов крови, которое широко используется в клинике в качестве диагностического теста для оценки интенсивности кроветворения.