Методы специфического окрашивания.

Основным методом специфического выявления дезоксирибонуклеиновых кислот считается реакция Фельгена. Она основана на кислотном гидролизе нуклеиновой кислоты, при котором от дезоксирибозофосфата отщепляются сначала пурины, затем – пиримидины и в результате освобождаются реакционноспособные альдегидные группы. Оптимальное время гидролиза варьируется в зависимости от объекта изучения и метода фиксации.

Реакция ядерного материала после предварительного гидролиза осуществляется с реактивом Шиффа (фуксинсернистая кислота). Приготовление реактива Шиффа: растворяют 1 г основного фуксина в 100 мл дистиллированной воды, нагретой до кипения, и дают раствору остыть до 60^о. Затем его фильтруют и добавляют 2 г бисульфата или метабисульфата натрия или калия и 20 мл 1н. HCl.

Полученную смесь выдерживают в закрытой посуде в темноте при комнатной температуре 18-24 ч, после чего добавляют 300 мг активированного древесного угля, энергично встряхивая в течение 1 мин, и фильтруют. Полученный раствор должен быть прозрачным светло-желтого цвета. Хранят его в хорошо закрытой посуде, обернутой черной бумагой, в холодильнике. Раствор становится непригодным, когда появляется розовая окраска.

Реакция Фельгена (модификация по Р. Лили). Эта методика дает хорошие результаты для материала, фиксированного в жидкости Карнуа и формалине. Депарафинированные срезы споласкивают в дистиллированной воде, затем помещают в предварительно нагретую до 56-60^о 1 н. HCl и выдерживают при этой температуре 10-15 мин.

Погружают стекла в реактив Шиффа на 10 мин. Стаканчик с реактивом должен быть обернут черной бумагой. Последовательно промывают в трех сменах (1, 2 и 2 мин) сернистой воды. Затем промывают 5 мин в проточной воде, докрашивают в течение нескольких секунд в 0,01% спиртовом растворе прочного зеленого (эту стадию можно опустить), обезвоживают и заключают в канадский бальзам.

Результаты окраски: ядерный хроматин окрашивается в темный пурпурно-красный цвет.

Метиловый-зеленый-пиронин. Этот метод специфически дифференцирует ДНК (зеленый цвет) и РНК (красный цвет).

Лучшие результаты после фиксации в жидкости Карнуа или абсолютном спирте. Состав красителя по Унна: метиловый зеленый - 0,15 г; пиронин - 0,25 г; 96^о-й спирт - 2,5 мл; глицерин - 20 мл; 0,5%-й водный раствор карболовой кислоты - 100 мл. Депарафинированные срезы доводят до воды и окрашивают в течение 20 мин. Промывают охлажденной дистиллированной водой (лучше свежеперегнанной), быстро обезвоживают ацетоном, просветляют смесью ацетон-ксилол (1:1), и через 2 смены ксилола заключают в канадский бальзам.

Результаты окраски: ядра - голубовато-зеленые; ядрышки - красные; цитоплазма – от розового до красного.

Метод Шабадаша (реакция на гликоген). Поскольку гликоген не растворим в крепких спиртах, для его фиксации пользуются спиртовыми растворами. Часто применяют фиксатор Карнуа или спирт-формол.

Метод Шабадаша основан на том, что периодат калия или натрия при воздействии на полисахариды окисляет спиртовые группы, превращая их в альдегидные, которые, реагируя с фуксинсернистой кислотой, дают красно-фиолетовое окрашивание соответствующих включений. Депарафинированные срезы промывают в 2 сменах дистиллированной воды и помещают на 10-15 мин в 0,01 М раствор периодата калия или натрия. Этот раствор следует готовить заранее, учитывая, что периодаты плохо растворяются в воде. Хранят его в темной посуде. Стекла со срезами промывают в 3 сменах дистиллированной воды (по 3 мин) и помещают на 20-25 мин в реактив Шиффа, который также хранится в темной посуде. Затем промывают в 3 сменах сернистой воды (по 3 мин), споласкивают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в канадский бальзам. При необходимости можно докрасить ядра гематоксилином.

2. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 5), окрашенные различными красителями. Зарисуйте и подпишите увеличение и тип красителя.

Таблица 5

Препараты тканей, окрашенные разными красителями

№	Название препарата	Тип окраски
Окраска гематоксилином
1.	Поперечно-полосатая мышечная ткань языка (Атлас, фото 5)	Окраска гематоксилином-эозином
2.	Поперечно-полосатая мышечная ткань языка (Атлас, фото 6)	Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну
Специфические окраски
3.	Жировая ткань (Атлас, фото 7)	Окраска Суданом - III
4.	Печень (Атлас, фото 8)	Окраска по Шабадашу на гликоген
5.	Сосуд эластического типа (Атлас, фото 9)	Окраска орсеином на эластические волокна
6.	Кость (Атлас, фото 10)	Окраска по Шморлю карболовым фуксином с дифференцировкой карбонатом лития
7.	Астроцитная глия (Атлас, фото 11)	Импрегнация серебром элементов нервной ткани
8.	Реакция на ДНК (Атлас, фото 12)	Окраска реактивом Шиффа
9.	Хроматофильная субстанция в нейронах (Атлас, фото 13)	Окраска по Лёфлеру метиленовой синью
10.	Гипофиз (демонстрационный препарат) (Атлас, фото 14)	Окраска по Маллори