2. Подготовка испытуемых сывороток и контрольных образцов

- Если тест-система укомплектована контрольными сыворотками в рабочем разведении, то они не требуют дополнительных разведений. При укомплектации тест-систем контрольными сыворотками (отрицательной, положительной, диагностической) в сухом виде или исходными растворами - необходимо приготовить рабочие разведения, в концентрациях, указанных в инструкции или непосредственно на флаконах.

Подготовленные испытуемые сыворотки разводят раствором для разведения сывороток в отдельных планшетах. Нельзя применять для предварительного разведения сывороток неиспользованные планшеты из наборов с сорбированными антигенами или антителами. Разведенные сыворотки хранению не подлежат.

Для получения рабочих разведений в соотношениях, которые указываются в инструкции, например: 1:100 или 1:200, т.е. к 100 или, во втором случае к 200 частям раствора для разведения сыворотки добавляется 1 часть нативной сыворотки обследуемого.

Если сыворотки испытуемой или контрольной взяли объем, равный 0,01 мл, то при разведении 1:100 необходимо взять 1 мл раствора для разведения сыворотки (0,01 мл х 100 частей = 1,0 мл), а при разведении 1:200 необходимо взять 2 мл раствора для разведения сыворотки (0,01 мл х 200 частей = 2 мл).

Приготовление рабочих растворов контрольных сывороток

тест-ситемы (К+, К-, К ) требуется только в тест-системах, где это

д

указано в инструкции.

Следует учитывать, что сыворотки и типичные разводящие растворы для сывороток могут различаться по плотности и вязкости. Поэтому при приготовлении разведений их следует тщательно перемешать пипетированием.

3. Нанесение на планшет испытуемых и контрольных образцов

При скрининге сыворотки исследуют в одном диагностическом разведении, внося их во все лунки планшета, кроме одной (контроль конъюгата).

Следует убедиться в том, что исследуемый образец или реагент внесен в лунку.

Испытуемые и контрольные образцы сывороток вносят в соответствии с протоколом исследования (см. Прилож. 3).X

При тестировании проб сывороток в последовательных двукратных разведениях (титрование) их разводят на том же растворе во вспомогательных рядах пробирок или лунок планшетов для микротитрования. Контрольные образцы (К+, К-) вносят без раститровки.

Реакция связывания антител с антигенами начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сывороток на планшет. В случае длительного времени внесения образцов (например, постановка цельного планшета) рекомендуется перестановка сывороток, дающих оптическую плотность в ближайшем к серой зоне районе оптических плотностей.

Если допущена ошибка при внесении анализируемых образцов (например, 2 сыворотки внесены в одну лунку), нельзя, опорожнив эту лунку, вносить в нее новый образец - такая лунка бракуется.

4. Инкубация

Планшет закрывается крышкой и инкубируется при температуре и сроке в соответствии с инструкцией по применению.

5. Промывка

Несвязавшиеся компоненты сыворотки удаляют из лунок планшета отсасыванием или вытряхиванием в дезраствор. Отмывка оставшихся в лунках несвязавшихся компонентов сыворотки осуществляется рабочим раствором ФСБ. При этом заполняют лунки до краев, не переливая через край, количество промывных циклов регламентируется инструкцией по применению. Равномерность заполнения и опорожнения всех лунок планшета, а также отсутствие пузырьков воздуха контролируют визуально в процессе промывки.

6. Внесение конъюгата

Внесение конъюгата в лунки планшета (стрипа) производится в рабочем разведении и объеме, соответствующем инструкции по применению.

Инкубацию планшетов (стрипов) с конъюгатом проводят в соответствии с инструкцией по применению. После чего несвязавшийся конъюгат удаляется и проводится промывка лунок, как указано выше.

7. Нанесение субстратной смеси

Рабочий раствор субстратной смеси готовится непосредственно перед использованием (следует исключить воздействие прямого солнечного света) и вносится в лунки в объеме, предусмотренном инструкцией по применению.

Завершающий этап реакции - выдерживание внесенного рабочего раствора субстрата на планшете (стрипе) в темном месте (или сверху закрыть темной бумагой) при комнатной температуре до полного развития окраски при АСК в качестве хромогена или определенное время (указанное в инструкции) при использовании ОФД или ТМБ.

Перед учетом результатов реакцию останавливают внесением в планшет стоп-реагента, если это предусмотрено инструкцией по применению.