5.3.4. Правила работы с ингредиентами тест-систем ифа

Хранение и использование тест-систем ИФА

Использовать реагенты и тест-системы не позднее указанного срока годности (при соблюдении условий хранения).

Не использовать реагенты из разных серий тест-систем ИФА, даже одного наименования.

Хранить реагенты и тест-системы, строго соблюдая условия, указанные производителем.

Перед использованием в ИФА температура всех реагентов должна быть доведена до комнатной - (18 +/- 2) °С.

Неиспользованные стриповые планшеты тест-систем ИФА должны храниться в закрытых полиэтиленовых пакетах или фольге с вложенным поглотителем влаги (при его наличии).

Требования к посуде и наконечникам для пипеток

1. Использовать наконечники для пипеток в процессе постановки ИФА однократно.

2. По окончании постановки наконечники пипеток, используемые для разных ингредиентов, моют и обрабатывают отдельно.

3. Отбор концентрата ТМБ проводить только новыми наконечниками.

4. Наконечники, используемые для внесения субстратной смеси с разными хромогенами, хранить и использовать раздельно.

5. Для каждого из используемых в ИФА реагентов необходимо иметь отдельную посуду и наконечники.

6. Для мытья посуды и наконечников не использовать синтетические моющие средства.

Постановка реакции

1. При использовании замороженных образцов сывороток или других ингредиентов необходимо полностью разморозить их и затем перемешать пипетированием.

2. При разведении образцов сывороток и других ингредиентов необходимо тщательно перемешивать приготавливаемый раствор.

3. Все лунки планшета должны равномерно заполняться вносимыми реагентами.

4. При промывании планшетов необходимо заполнять лунки промывочным раствором полностью.

5. Избегать подсыхания лунок планшетов между внесением растворов.

6. Не касаться дна лунок планшетов во избежание их загрязнения.

7. Строго соблюдать временной и температурный режим постановки ИФА.

8. При учете результатов необходимо визуально контролировать показатели ОП, полученные на ридере.

9. Использовать только поверенные и аттестованные измерительные приборы (ридер, рН-метр и др.)

Правила работы с ингредиентами

1. Все используемые в ИФА хромогены являются свето- и влагочувствительными, поэтому должны храниться в плотно закрытой посуде в сухом и темном месте.

2. Не следует использовать сломанные таблетки хромогенов.

3. Не следует использовать флаконы с жидкими компонентами тест-системы, в которых наблюдается бактериальный рост или изменение цвета раствора.

4. Для приготовления растворов реагентов следует использовать дистиллированную воду.

Помимо описанного метода постановки ИФА в лунках планшетов или стрипов, существуют тест-системы с твердофазным носителем других форм (гребни, шараки, пробирки и т.д.).

5.4. Порядок направления рекламации поставщикам

(производителям) диагностических тестов

При направлении поставщикам (производителям) диагностических медицинских иммунобиологических препаратов рекламаций на качество тест-систем необходимо учитывать следующее:

- рекламации предъявляются лишь к сериям иммунобиологических препаратов, у которых не истек срок годности;

- рекламация направляется в два адреса - предприятию-изготовителю (адрес на упаковках диагностических наборов) и в Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской медицинской Академии им. И.М. Сеченова (г. Москва, ул. М. Пироговская, д. 20);

- в рекламации следует подробно изложить претензии, предъявляемые к тест-системе (серии) диагностического препарата, а также приложить копии протоколов опытов, свидетельствующих о неудовлетворительном качестве препаратов;

- одновременно с рекламацией в адрес института отправляются (авиапочтой или с нарочным) тест-системы (невскрытые) из рекламационной серии.

5.5. Лабораторный контроль

Качество и достоверность лабораторных исследований зависят от организации внешнего и внутреннего лабораторного контроля, которые состоят из отдельных процедур (методик), направленных на получение надежных и сопоставимых результатов анализов.

5.5.1. Внутренний лабораторный контроль

Контроль качества внутренний (внутрилабораторный) - система мер, предназначенных для оценки качества результатов анализа, полученных в лаборатории. Внутренний контроль качества лабораторных исследований - это комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на обеспечение и контроль стабильности требуемых условий для проведения анализов, а также предупреждения неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе подготовки, выполнения и оценки результатов анализа.

Внутрилабораторный контроль качества включает контроль воспроизводимости и точности (правильности) и может осуществляться с помощью методов, использующих специальные контрольные материалы или средства ряда методов, не требующих контрольных материалов.

Внутрилабораторный контроль качества предусматривает оценку деятельности всего медперсонала, участвующего в этапах работы, т.к. на любом из них возможны ошибки, связанные с подготовкой больного к исследованию, забором пробы, ее подготовкой к исследованию, хранением образцов и т.д. Возможны неточности при выписке и регистрации готовых анализов, а также в их трактовке.

Комплекс организационно-технических мероприятий, позволяющих контролировать технические и метрологические характеристики выпускаемых изделий, осуществляется на основе положения Государственной системы обеспечения единства измерений (ГСИ).

Для вновь разработанных приборов и установок проводят государственные испытания. Для изделий, изготовленных серийно, проводят испытания на заводе-изготовителе при выпуске.

Измерительные приборы подлежат поверке в соответствии с ГОСТ 8002-71. В соответствии с руководством по метрологическому обеспечению средств измерений определен порядок и сроки поверки измерительных приборов в лабораториях. Измерительные приборы поверяются ведомственными метрологическими органами в соответствии с инструкцией, в которой указываются производимые операции и средства поверки. Поверке подлежат все технические и метрологические показатели, записанные в паспорте, прилагаемом к прибору. Работать на неповеренном приборе запрещается.

В каждой лаборатории необходимо проводить контроль качества используемого оборудования, который включает поверку и регистрацию состояния холодильников, водяных бань, термостатов, пипеток, таймеров, а также контроль качества дистиллированной воды (чистота, величина рН) в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".

Паспорт производителя. К каждой серии наборов производитель

прикладывает паспорт, в котором отражены, в т.ч., значения ОП и

К+

ОП . В случае, если получены результаты, сильно отличающиеся от

К-

паспортных, следует проверить еще раз правильность постановки ИФА

и, исключив возможность ошибки в проведении анализа и

интерпретации полученных результатов, обратиться к производителю

тест-систем.

Лабораторный контроль качества испытуемых тест-систем

осуществляется в процессе их использования по показателям ОП всех

контрольных точек (К+, К-, К , контроль конъюгата), определяемых

д

паспортом производителя и инструкцией по применению.

Методы контроля качества, не требующие контрольных материалов

В лабораторной практике достаточно широко применяют методы контроля качества, в которых используют результаты исследования образцов пациентов.

Основные преимущества этих методов:

1. Не требуют специального контрольного материала.

2. Обнаруживают ошибки, не выявленные другими методами.

3. Распространяют контроль на весь процесс исследования.

К ним относятся:

1. Метод параллельных проб.

2. Исследование случайной пробы.

3. Исследование повторных проб.

Методы позволяют оценить воспроизводимость результатов исследований с помощью образцов сыворотки (плазмы) больных.

Контроль качества при проведении иммунологических (серологических) исследований

Основные направления в организации внутреннего контроля качества и в первую очередь контроля соблюдения требований к условиям проведения анализа (лабораторные помещения, воздушная среда, температурные режимы инкубации и хранения, режимы дезинфекции и стерилизации) определены в нормативно-методической документации: МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды", СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

Перед проведением анализа контролируется следующее:

1. При получении новой серии наборов тест-систем следует обязательно прочитать инструкцию. Практически все тест-системы совершенствуются, что может отразиться на методиках подготовки реактивов и протоколе реакции. Кроме того, тест-системы одного типа, но выпущенные разными предприятиями, могут иметь свои особенности постановки.

2. Хранить реагенты и тест-системы, строго соблюдая условия, указанные производителем. Использовать реагенты и тест-системы не позднее указанного срока годности (при соблюдении условий хранения). Неиспользованную часть планшета (стрипы) необходимо хранить в герметично закрытом (заклеенном) пластиковом пакете или в фольге, вкладывая внутрь пакетик с силикагелем для поглощения влаги.

3. Нельзя использовать наборы с истекшими сроками годности и смешивать реактивы из разных серий наборов.

4. Строго соблюдать временной и температурный режим постановки ИФА. При проведении реакции при низких температурах в лабораторных помещениях необходимо поддерживать комнатную температуру 18 +/- 2 °С с помощью комнатных обогревателей или пользоваться при выполнении реакции ИФА настроенным на комнатную температуру термостатом.

5. Перед началом работы коробка набора должна быть вскрыта, а компоненты выдержаны при комнатной температуре в течение не менее 30 мин.

6. Если планшет разборный и используются не все стрипы сразу, то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, который необходимо закрыть. Не следует удалять пакетик с влагопоглотителем.

7. При использовании замороженных образцов сывороток или других ингредиентов необходимо полностью разморозить их и затем перемешать пипетированием.

8. Флаконы с лиофилизированными реактивами следует вскрывать осторожно, не допуская потери материала. Так же осторожно нужно вносить во флакон растворитель, чтобы струей жидкости или током воздуха не удалить из флакона часть порошка. Растворять лиофилизат (не допуская вспенивания!) следует не менее 20 мин., периодически покачивая закрытый флакон.

9. Растворение всех ингредиентов следует тщательно контролировать визуально, особенно это касается таблеток ортофенилендиамина.

10. Если производитель использует осушитель, меняющий цвет при насыщении влагой (наиболее распространена смена цвета с синего на розовый), запрещается использовать планшет в случае достижения осушителем "неправильного" цвета.

11. Серную кислоту для остановки ферментативной реакции следует вносить в лунки энергичным нажатием поршня пипетки ("вспрыскиванием"), чтобы кислота хорошо перемешалась с субстратной смесью.

12. Использовать только специально предназначенные и подписанные емкости для приготовления реагентов.

13. Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны.

14. Планшеты (стрипы) можно использовать для постановки ИФА только один раз.

15. Нельзя касаться внутренней поверхности лунки наконечником при внесении образца или реактива. Добавляя пробу в лунку с жидкостью для разведения образцов, обязательно 4 - 5 раз перемешивать содержимое лунки, насасывая его в наконечник и выпуская в лунку ("пипетирование"). Вносить пробы или реактивы следует, не допуская вспенивания и загрязнения соседних лунок.

16. Перед инкубацией планшет необходимо закрывать крышкой. Это предотвращает излишнее испарение воды из лунок, оседание реактивов на их стенках и последующие ложноположительные результаты.

17. При промывании планшетов лунки следует заполнять отмывающим буфером почти до краев, но не допуская их переполнения через край. Целесообразно оставлять буфер в лунках на 20 - 30 с перед его удалением (отсасыванием). После промывания планшет следует перевернуть и легким постукиванием (о чистую фильтровальную бумагу, стерильную многослойную марлю, ветошь) удалить остатки жидкости из лунок.

18. Не следует допускать подсыхания лунок в период между инкубациями или промывками - возможно образование плохорастворимой пленки на их поверхности. Если очередной компонент не вносится сразу, планшет необходимо перевернуть вверх дном на фильтровальную бумагу до момента внесения реактива. В случае необходимости длительного перерыва следует положить планшет вверх донышками лунок на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу, в норме - не допускать длительного перерыва.

19. Все лунки планшета должны равномерно заполняться вносимыми реагентами.

20. Жидкость для разведения проб содержит реактив, изменяющий цвет при внесении образца в лунку; в таких наборах ошибочно не внести пробу невозможно.

21. При учете результатов необходимо визуально контролировать показатели ОП, полученные на ридере.

22. При использовании стрипов следует работать с обязательной фиксацией стрипов в рамке. При наличии на донышках стрипов или планшетов (наружная поверхность, которая соприкасается с поверхностью стола) капель влаги, пылинок и других загрязнений следует осторожно протереть донышки лунок с помощью мягкой, не оставляющей волокон салфетки до регистрации оптической плотности.

23. Не следует касаться дна лунок с внешней стороны - отпечатки пальцев или перчаток могут привести к неправильной регистрации оптической плотности.

Требования к посуде и приборам

1. Для приготовления ингредиентов следует использовать химически чистую посуду из нейтрального стекла. Нельзя использовать металлическую посуду!

2. Посуда для субстратной смеси и наконечники пипеток, которыми она вносится в планшет, должны быть идеально чистыми. Наличие даже следов хлорамина приводит к неспецифическому окислению ортофенилендиамина (ОФД) и браковке результатов анализа. Необходимо выделить отдельную посуду для приготовления и манипуляций с растворами конъюгата, ТМБ и ОФД. Посуду для растворов ТМБ, ОФД и конъюгата необходимо мыть более тщательно, так как влияние возможных загрязнений на эти растворы сильнее отражается на результате анализа.

3. Периодически следует проверять точность работы автоматических одно- и многоканальных пипеток, а также смазывать их поршни специальной смазкой по инструкции, которая прилагается к каждой пипетке.

4. По возможности следует избегать повторного применения пластиковых наконечников к микродозаторам. В случае необходимости наконечники должны промываться проточной водой, при этом необходимо следить за тем, чтобы промывалась внутренняя часть наконечников, после чего они должны быть промыты и прокипячены в дистиллированной воде. Для мытья посуды и наконечников нельзя использовать синтетические моющие средства (см. п. 5.3.4.1).X

5. Наконечники, соприкасавшиеся с контрольной положительной сывороткой, использовать нельзя, в т.ч. после мытья и дезинфекции.

6. Для каждого из используемых в ИФА реагентов необходимо иметь отдельную посуду и наконечники. Наконечники, используемые для внесения субстратной смеси с разными хромогенами, хранить и использовать раздельно.

7. При работе одно- и многоканальными пипетками следует визуально контролировать забор ингредиентов в наконечники. Неправильное дозирование растворов на любой стадии анализа может привести как к росту, так и к снижению оптической плотности, замеряемой при оценке результата анализа.

Наиболее простой способ проверки пипетки - взвешивание дистиллированной воды, дозируемой пипеткой. Вес 1 мкл дистиллированной воды при комнатной температуре с большой точностью равен 1 мг. Таким образом, настроив пипетку на дозу 100 мкл, мы должны получить вес воды около 100 мг.

8. Использовать только метрологически поверенные и аттестованные измерительные приборы (спектрофотометры, рН-метр и др.)

Спектрофотометры являются самыми сложными из необходимых для постановки иммуноферментного анализа приборов.

Спектрофотометры различных фирм могут сильно отличаться конструктивно. Подключать спектрофотометр следует совместно со специалистами; в работе с прибором необходимо следовать инструкции по настройке программ с учетом его эксплуатационных особенностей (например, длительности времени прогрева спектрофотометра). Нарушение требований инструкции по эксплуатации прибора может привести к неправильному измерению оптической плотности.

9. Как ручные, так и автоматические промыватели в конце рабочего дня следует тщательно промывать дистиллированной водой для предотвращения проростов в шлангах. Недостаточная промывка, например при засорении каналов промывателей, приводит обычно к завышению сигнала. Может быть засорение пространства между иглами промывателя кусочками марли или ваты. Такое засорение приводит к заносу растворов из одной лунки в другие.

10. В случае необходимости следует прочистить мандреном отверстия промывочного аппарата (вошера). Особо тщательно планшет (стрипы) должен быть промыт после инкубации с конъюгатом, т.к. именно следы неотмытого конъюгата - частая причина ложнопозитивных реакций.

11. В случае получения оптической плотности от контрольных образцов, не попадающих в интервал, описанный в соответствующем разделе инструкции, следует считать, что имеются ошибки при подготовке или постановке реакции либо тест-система непригодна к применению.

12. Если используется ридер без калибровочного фильтра на 620 - 630 нм, следует учитывать возможность того, что мутные или загрязненные области планшета могут быть зарегистрированы с завышенным значением реальной оптической плотности.

13. Необходимо сличать полученную распечатку оптической плотности лунок с визуальной оценкой. Возможны искажения реальной оптической плотности в результате попаданий соринок в лунку или загрязнений донышка лунки.

Требования к наконечникам микродозаторов:

1. Наконечники для автоматических пипеток желательно использовать однократно.

2. Лаборатории, у которых нет возможности однократного использования наконечников, должны соблюдать правильность обработки наконечников, при которой, важно чтобы были учтены следующие моменты:

- замачивание в 6%-ном растворе перекиси водорода;

- промывка после перекиси;

- кипячение;

- высушивание.

Методика дезинфекции наконечников и подготовки к повторному использованию

- Замачивание на 24 ч в 6%-ном растворе перекиси водорода, содержащем 0,5% жидкого моющего средства (типа жидкости для мытья посуды серии "Клер" по ТУ 2383-001-26332142-99) или хозяйственного мыла (50 г на 10 л воды).

Категорически запрещается использовать синтетические моющие средства (СМС) в виде любых стиральных порошков!

- Промывка холодной водой - 10 раз.

- Промывка дистиллированной водой - 2 раза.

- Кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 40 мин.

- Сушка в сухожаровом шкафу при 80 °С не менее 5 - 6 ч до полного высыхания.

- Раскладка наконечников в штативы только пинцетом!