Практическая работа №12 Принцип метода

Триглицериды пробы образуют в результате сопряженных реакций, описанных ниже, цветной комплекс, который может быть измерен спектрофотометрически 1,2

липиза

Триглицериды + Н2О ___________ глицерол + жирные кислоты

глицеролкиназа

Глицерол + АТР ____________ глицерол 3-Р+ADP

G3P - оксидаза

Глицерол 3 Р+О2 ____________ дигидроксиацетон Р+Н2О2

пероксизада

2Р2О2+4 Аминоатипирин+4 хлорфенол ____________ хинонимин + 4 Н2О

Процедура

1. Подогреть реагенты до комнатной температуры

2. Разлить в промаркированные пробирки

3. Тщательно перемешать и инкубировать 15 минту при комнатной температуре 16-25 С или 5 минут при 37 С

4. Измерить абсорбцию А ст андарт и образца при 500 нм против холостой пробы. Окраска раствора стабильна меннее 2 часа

	Холостая проба	Стандарт	образец
Стандартная тг	-	10 мкл	-
Образец	-	-	10 мкл
Реагент А	1,0 мл	1,0 мл

Расчет

А Образца

------------------- х с стандарта = С образца

А стандарта

Если для калибровки используется постаяляемый стандарт триглицеридов

А образца х 200 = мг/ дл триглицеридов

---------------

А стандарта х 2,26= моль /л триглицеридов

Нормальные значения

150 мг/дл = 1,7 ммоль/л

150-199 мг/дл = 1,70-2,25 ммоль/л

240-499 мг/дл =5,64 ммоль/л

500 мг / дл = 5,65 ммоль/л

Триглицериды – эфиры глицерола и жирных кислот, поступающие с пищей или синтезированные в печени. Триглицериды транспортируются в плазму липопротеинами и используются в жировой ткани, мышцах и т.д. Главная функция триглицеридов обеспечение энергией клетки.

Повышение уровней триглицеридов в сывортке крови может быть вызвано заболеваниями печени, сахарным диабетом , нефрозом, гипотироидизмом, алкоголизмом.

Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30), но и ему присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин.

Знак и величина электрического заряда молекул белков сыворотки крови, а значит, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении, зависят от значения рН и ионной силы среды. Кроме того, скорость движения белковых молекул определяется их молекулярной массой, ионным окружением (составом и концентрацией буфера), приложенным напряжением и другими факторами. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенных значениях указанных параметров. В буферном растворе с рН=8,6 или 8,9 и ионной силой 0,08–0,15 моль/л все белки сыворотки крови приобретают отрицательный заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются a₁-, a₂-, β- и g-глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на несколько подфракций.

Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза; в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином могут образовать дополнительные полосы в области a₂- и β -глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b-фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С₃-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов.

Реактивы, оборудование и исследуемый материал:

Агарозный гель, буфер ТВЕ (Tris-Borate-EDTA), бромистый этидиум, краситель кумасси, уксусная кислота, спирт этиловый, источник тока, ячейка электрофореза, микродозатор, разные носадки, штатив для насадок, штатив для микродозатора.