Порядок выполнения работы.

1. Подборка соотвествующего геля .

2. Нанесение в ячейки пластины геля исследуемой сыворотки крови (донорской).

3. В общую ячейку электрофореза наливаем соотвествующий буферный раствор.

4. Погружение в буферный раствор гелевой пластины (с сывороткой крови).

5. Включение электропитания и присоединение ячейки электрофореза (см. приложение).

6. Выбор постоянного параметра

7. Запуск работы.

8. Продолжительность разгонки согласно методики.

9. Окрашевание геля (соотвествующим красителем).

10. Помещение гелевой пластины в гельдок.

11. Анализ и интерпретация полученных результатов.

Приготовление агарозных гелей и электрофорез.

1. Добавьте рассчитанное количество порошка агарозы в отмеренный объем

электрофорезного буфера.

2. Нагрейте взвесь в бане с кипящей водой или в микроволновой печи до тех пор, пока

агароза не растворится. Агарозу довести до кипения, кипятить 30-60 сек (вынимать из

микроволновой печи осторожно – может резко вскипеть).

3. Остудите раствор до 50-60оС и добавьте бромистый этидий (из водного раствора,

содержащего 10 мг/мл и хранящегося при 4оС в светонепроницаемом сосуде) до

конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

4. Налить определенного объема геля в планшет.

5. Установите гребенку в плошку для агарозы. Необходимо, чтобы между дном лунки и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5-1,0 мм, т.е. чтобы дном лунки служил агарозный гель

6. После того как гель полностью затвердеет (через 30-45 мин при комнатной

температуре), осторожно удалите гребенку и поместите гель в электрофорезную

кювету.

7. Добавьте достаточное количество электрофорезного буфера ТВЕ (Tris-Borate-EDTA), так чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1 мм.

8. Подсоедините электроды к источнику напряжения. Напряженность при проведении разделения в агарозных гелях составляет 120 V, 40 A, 90 мин.

9. По окончании разделения выньте пластинку с гелем из кюветы и поместите гель вместе с пластинкой в красящий раствор (1 мкг/мл бромистого этидия). Будьте осторожны! Гель хрупок и легко соскальзывает с пластинки.

Стандартные растворы.

1. Раствор для окрашивания (0.025% Кумасси ярко голубой R 250, 40% этанол, 7% уксусная кислота). Растворите в 800 мл этанола 0.5г. Кумасси ярко голубого R 250. После этого добавте к полученному раствору 140мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 2 литров с помощью дийонизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре не более 6 месяцев. 2. Раствор для проявления 1. (40% метанол, 7% уксусная кислота) Смешайте 400мл метанола с 70мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 1 литра с помощью деионизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре. 3.Раствор для проявления 2. (5% этанол, 7% уксусная кислота) Смешайте 500мл метанола с 700мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 10 литров с помощью деионизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре.

Последовательность окрашивания геля с помощью Кумасси ярко голубого R 250. 1. Поместите гель в раствор для окрашивания. Окрашивание проводиться в течение 2-4 часов при медленном перемешивании на шейкере. 2. Удалите раствор для окрашивания и поместите гель в раствор для проявления 1 на 30 мин при медленном перемешивании. 3. Удалите раствор для проявления 1. Поместите гель в раствор для проявления 2 и оставьте гель при медленном перемешивании пока с геля не исчезнит фон. В процессе проявления геля рекомендуется 2-3 раза менять раствор для проявления 2 для достижения более высокого качества проявки.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Диагностическое значение имеет определение не только общего содержания белка но и соотношения между отдельными его фракциями в сыворотке крови, поскольку выяснение этих соотношений позвроляет выявить ряд заболеваний, при которых общее содержание белка в крови не изменяется.

Одним из распространенных в клинических лабораториях методов определения белковых фракций в сыворотке крови является метод электрофорез на агарозном геле