Теоретическая часть

Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат информа­цию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных мета­болитов (плазмиды деградации).

Как автономно реплицирующиеся генетиче­ские элементы плазмиды обладают всеми ос­новными свойствами, которые позволяют ис­пользовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК.

В качестве такого вектора может использоваться плазмидный вектор pBR322, созданный Ф. Боливаром и Р. Родри­гесом. Он имеет длину 4361 п. н. и несёт два гена устойчи­вости к антибиотикам (рис. 4.7), ампициллину (Amp^r) и тетрациклину (Tet^r), а также уникаль­ные сайты рестрикции для ВатHI, HindIII и SalI в гене Tet^r, один PstI-сайт в гене Amp^r, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli.

Для образования гибридных молекул pBR322 и донорную ДНК, содержащую нужный ген обрабатывают одной и той же рестриктазой, в результате чего у них образуются комплиментарные липкие хвосты. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТР для устранения разрывов. Так же, во избежание связывания и плазмид и донорских ДНК между собой, исходные плазмиды обрабатываются щелочной фосфатазой.

Плазмида pUС19 длиной 2686 п. н. содержит: ген устойчивости к ампициллину; ре­гулируемый сегмент гена р-галактозидазы (lacZ') лактозного оперона Е. coli; ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер — короткую последова­тельность с множеством уникальных сайтов узна­вания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, KpnI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SaiI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плаз­миды pBR322.

Рис. 2. Генетическая карта плазмидного вектора pUC19.

При отборе трансформированных клеток руководствуются следующими соображениями. Если клетки, содержащие немодифицирован- ную плазмиду pUC19, выращивать в присутст­вии изопропил-р-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lacI не сможет свя­заться с промоторно-операторной областью ге­на lacZ', и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фраг­мента гена lacZ'. Продукт этого фрагмента свя­жется с белком, кодируемым хромосомной ДНК, и в результате образуется активная β-галактозидаза. Последовательность с множест­вом сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на продукцию функциональной Р-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-З-индолил-β-О-галактопиранозид (X-Gal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, со­держащих немодифицированную плазмиду pUC19.

Рис.3 Схема трансформации бактериальных клеток. (http://samlib.ru/o/oleg_w_m/cdocumentsandsettingsolegmoidokumentyosnowygennojinzheneridljanachinajushihbiotehnologowrtf.shtml)