Теоретическая часть

Любое вещество, обладающее свойствами антигена, полноценного или неполноценного (гаптена), можно количественно определить с применением иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА необходимо иметь очищенный или неочищенный антиген, специфическое антитело, фермент в качестве метки для антигена или антитела и средство для регистрации активности фермента.

Вестерн блоттинг – аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. В методе используется 1D –электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по молекулярной массе с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану с детекцией с помощью специфических антител. При использовании электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лемли обычно исходят из следующих допущений:

- белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;

- количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;

- собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

Иммунопреципитация – метод выделения белка из сложных смесей, таких как клеточные лизаты, сыворотки, тканевые гомогенаты с помощью специфических к белку антител, сорбированных на гранулах. Ко-иммунопреципитация - это иммунопреципитация целого белкового комплекса, которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков, входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс. В результате появляется возможность идентифицировать все белки, входящие в состав комплекса. Иммунопреципитация часто дополняется Вестерн блоттингом или ИФА-анализом.

Практическая часть Лабораторная работа №1.

Определение лептина сыворотки крови (с использованием тест-системы Leptin ELISA, DBS, Канада).

Принцип метода: тест-система представляет собой набор реагентов для определения уровня лептина в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела к лептину иммобилизованы на 96-луночном планшете, планшет разборный, состоит из стрипов. Вторые моноклональные антитела, специфичные к другому эпитопу лептина, коньюгированы с биотином. На первом этапе лептин, присутствующий в образцах и стандартных пробах с иммобилизированными антителами и с биотинилированными антителами образует “сэндвич”. Несвязавшиеся биотинилированные антитела удаляются при промывке. Далее добавляется стрептавидин, меченный пероксидазой. Далее добавляется субстрат для пероксидазы – тетраметилбензидин (ТМБ), дающий голубое окрашивание, пропорциональное количеству лептина. Химическая реакция останавливается добавлением стоп реагента (серная кислота), в результате чего окраска лунок меняется на желтый цвет. Интенсивность окраски считывается при 450 нм. Количество лептина в образце рассчитывается исходя из данных калибровочной кривой. При этом учитывается коэффициент разведения сыворотки крови. При построении калибровочной кривой учитываются предварительные данные по форме кривой, представленные в наборе.

Лептин – адипокин, гормон жировой ткани, находящийся в сыворотке крови. Уровень лептина повышен у больных с ожирением, с метаболическим синдромом. Определение лептина в сыворотке крови рекомендуется для контроля эффективности весо-редуцирующих лечебных и диетических мероприятий.

Реактивы:

1. Восьмилуночные стрипы с иммобилизованными антителами к лептину;

2. Антитела другого эпитопа лептина связанные с биотином (биотинилированные антитела);

3. Стрептавидин связанный с пероксидазой хрена (конъюгат);

4. Субстрат для пероксидазы – ТМБ;

5. Две виалы с контрольными образцами лептина (высокий и низкий уровень лептина) – контроль качества; контрольные образцы предназначены для общей оценки качества выполнения данного ИФА-исследования;

6. Концентрат раствора для промывания стрипов и разведения конъюгата;

7. Стоп-реагент (серная кислота).

Оборудование:

1. ИФА-анализатор;

2. Вошер;

3. Термошейкер.

Биологический материал: сыворотка крови.

Приготовление реагентов:

Общие рекомендации – все реактивы набора, необходимые для выполнения лабораторной работы, должны быть комнатной температуры.

А. Достать планшет из холодильника, отделить нужное количество стрипов, остальные стрипы убрать в холодильник, оставшиеся стрипы необходимо защищать от попадания влаги.

Б. Приготовление раствора для промывания стрипов

Раствор для промывания стрипов готовят из концентрата. Для этого необходимо рассчитать объем концентрата, необходимый для промывки 1 стрипа. Далее этот объем необходимо умножить на 9. Развести концентрат дистиллированной водой в соотношении 1/10. При наличии в исходном растворе осадка солей его необходимо подогреть при температуре 37˚С до полного растворения осадка. Оставшийся концентрат промывочного буфера хранить при Т=(6±2)˚С не более 1 месяца. Приготовленных раствор стабилен в течение 8 часов.

В. Приготовление коньюгата из концентрата.

Для приготовления рабочего раствора конъюгата необходимо отобрать из флакона концентрата коньюгата рассчитанное для покрытия выбранных стрипов количество концентрата и развести его Assay buffer. Остальной концентрат убрать в холодильник. Готовый раствор хранить не более 8 ч при Т=(6±2)˚С.

Г. Приготовление калибровочных растворов.

Калибровочные растворы готовы к применению.

Д. Подготовка контрольных образцов.

Контрольные образцы готовы к применению

Е. Подготовка исследуемых сывороток

Исследуемые сыворотки крови для данного набора не требуют разведения. В случае получения результатов, не укладывающихся в калибровочную кривую, необходимо образец сыворотки развести Assay buffer и выполнить исследование снова.

Ход работы:

1. Стрипы закрепить в рамке. Приготовить все необходимые реактивы. В лунки стрипов внести раствор по 20 мкл стандартных растворов, контрольных растворов и образцов сывороток крови. Стандартные растворы необходимо обязательно ставить в дублях.

2. Стрипы выдержать 1-2 мин. при комнатной температуре. Затем во все лунки добавить по 80 мкл биотинилированных антител (готовы к применению) и инкубировать 1 час на термошейкере (комнатная температура, 200 rpm)/

3. Лунки промыть трехкратно буфером для промывки на автоматическом промывателе. Остатки влаги удалить, постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге.

4. Пипетировать стрептавидиновый коньюгат по 100 мкл во все лунки, инкубировать 30 минут на термошейкере (комнатная температура, 200 rpm).

5. Лунки промыть трехкратно буфером для промывки на автоматическом промывателе. Остатки влаги удалить, постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге.

6. Пипетировать в лунки субстрат, инкубировать 10-15 минут при комнатной температуре.

7. Добавить стоп раствор.

8. Проконтролировать изменение цвета лунок и считать планшет на ИФА-анализаторе.

Регистрация и оценка результатов:

Учет результатов проводят с помощью анализатора колориметрического иммуноферментного. Регистрируют оптическую плотность в лунках планшетов при длине волны 450 нм. Исходя из предполагаемой формы калибровочной кривой выбирают вариант построения реальной калибровочной кривой: уравнение линейной функции, логарифмической, экспонециальной.

На основе данных калибровочной кривой рассчитывают данные уровня лептина в образцах сыворотки крови и контрольных образцах. При получении уровня лептина более 100 нг/мл рекомендуетсмя развести пробу в 8 раз assay buffer и выполнить новое исследование, при расчете результатов необходимо учесть фактор дилюции, равный 8.

Лабораторная работа №2.

Приготовление супернатантов ткани для ИФА-анализа и Вестерн блоттинга. Приготовление гелей для Вестерн-блоттинга и проведение электрофореза белков по Lemli.

Принцип метода: принцип получения супернатантов тканей для ИФА-анализа состоит в гомогенизации образца в жидком азоте до порошкообразного состояния, ресуспендировании его в буфере с последующим центрифугированием и выделением супернатанта. Принцип получения супернатантов тканей для Вестерн блоттинга состоит в гомогенизации образца в жидком азоте с ресуспендировании его в SDS-буфере с глицерином и бромфеноловым синим с последующим центрифугированием и выделением супернатанта.

Одним из важных этапов Вестерн блоттинга является электрофорез смеси денатурированных белков в полиакриламидном геле. Процент акриламида в разделяющем геле определяется молекулярной массой белка. При молекулярной массе белка 24-205 кDa процент акриламида составляет 7,5%.

Реактивы для приготовления супернатантов тканей для ИФА и Вестерн блоттинга:

1. 50 мМ трис-HCl-буфер (pH=7.5), содержащий 2 мМ АТР, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ EDТА и 100 мМ хлорид натрия;

2. 2ХSLB буфер с добавлением SDS и глицерина. Добавляется из расчета 50 мкл 2ХSLB буфера на 100 мкл приготовленного супернатанта ткани (при условии, что концентрация белка в пробе составила 3-4 г/л).

Реактивы для приготовления разделяющего и концентрирующего гелей для проведения электрофореза белков, буфера для проведения электрофореза:

1. Состав разрешающего геля: вода дистиллированная - 2,72 мл, 30% акриламид - 3,33 мл, трис-буфер (pH=8,8) - 3,75 мл, 10% SDS - 100мкл, персульфат аммония -100 мкл, TEMED -20 мкл;

2. Состав концентрирующего геля: вода дистиллированная 2,1 мл, 30% акрил амид - 500 мкл, трис-буфер (pH=6,8) – 375 мкл, 10% SDS - 30 мкл, персульфат аммония - 30 мкл, TEMED - 3 мкл;

3. Буфер для проведения электрофореза белков: 10ХTGB-буфер: 30,3 г. трис основного, 144 г. глицина, 10 г. SDS на 1 литр дистиллированной воды. Хранить при 4^оС. Необходимо развести водой в 10 раз перед использованием.

Оборудование:

1. Центрифуга с охлаждением типа Eppendorf;

2. Микродисмембратор ;

3. Ячейка для электрофореза;

4. Термостат с функцией кипячения проб.

Биологический материал: человеческий биопсийный или операционный материал.

Ход работы:

1. Получение супернатантов тканей для ИФА-анализа;

1.1 Замороженную ткань (около 100 мг) гомогенизировалть в жидком азоте на микродисмембраторе, затем ресуспендировать в 300 мкл 50 мМ трис-HCl-буфера (pH 7.5), содержащего 2 мМ АТР, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ EDТА и 100 мМ хлорид натрия.

1.2 Гомогенат центрифугировать в течение 20 мин при 10000 g и 4^оС (центрифуга типа Эппендорф).

1.3 Аспирировать и аликвотировать полученный супернатант. Полученные супернатанты тканей пригодны для выполнения ИФА-анализа. Количество супернатанта, необходимое для добавления в лунку, необходимо подбирать экспериментально исходя из рекомендаций к набору и данных литературы.

2. Получение супернатантов тканей для Вестерн блоттинг анализа;

2.1 Приготовить 2ХSLB-буфер. Ранее приготовленные супернатанты тканей для ИФА-анализа (100 мкл) развести в 50 мкл 2ХSLB-буфера. Супернатанты пригодны для Вестерн блоттинг анализа.

3. Денатурация белковых образцов;

3.1 Приготовленные SLB-пробы прогреть в термостате при 95^оС в течение 10 минут.

4. Приготовление разрешающего и концентрирующего гелей. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лемли. Оценка результатов;

4.1 Подготовить стекла для приготовления геля, залить разрешающий гель до метки.

4.2 Визуализировать полимеризацию геля, залить концентрирующий гель, вставить гребенку.

4.3 Визуализировать полимеризацию концентрирующего геля.

4.4 Убрать гребенку.

4.5 Залить в карманы денатурированные супернатанты.

4.6 Поместить гели в электрофоретическую камеру.

4.7 Камеру заполнить TGB-буфером и выбрать параметры для электрофореза.

4.8 Визуализировать прохождение электрофореза белков.

Лабораторная работа №3.

Получение экзосом из биологических жидкостей методом иммунопреципитации.

Экзосомы представляют собой микроскопические внеклеточные везикулы диаметром 30-100 нанометров, секретируемые различными клетками, детектируемые в различных биологических жидкостях человека (сыворотка крови, слюна, моча, грудное молоко), в том числе и патологических (асцитическая жидкость) и способные нести белковые маркеры и генетическую информацию, участвуя в межклеточной коммуникации. Опухолевые экзосомы оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, участвуя в опухолевой прогрессии.

Принцип метода: набор Exo Quick Exosome Precipitation представляет собой реагент для выделения экзосом из сыворотки крови или асцитической жидкости методом иммунопреципитации (вариант ко-иммунопреципитации).

Биологический материал: асцитическая жидкость, сыворотка крови. Не рекомендуется в данной работе использовать плазму крови, поскольку фибриноген мешает экстракции экзосом.

Ход работы:

1. К 250 мкл сыворотки прибавить 63 мкл Exo Quick Exosome Solution;

2. Смешать и инкубировать при 4^оС 30 минут;

3. Смесь центрифугировать при 1500 g при комнатной температуре в течение 30 минут;

4. Экзосомы после центрифугирования будут выглядеть в виде белого гомогенного осадка.

Интерпретация результатов:

Для подтверждения экзосомальной фракции необходимо провести типирование полученного препарата экзосом на наличие CD63 или СD9, например, методом Вестерн блоттинг.