Практическая часть

Лабораторная работа №1.

Полимеразная цепная реакция

Принцип метода: ПЦР позволяет избирательно синтезировать in vitro небольшие фрагменты ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, благодаря чередующимся стадиям денатурации, отжига и элонгации.

Оборудование:

1. Амплификатор ДНК — программируемый термостат, позволяющий задавать температурный режим, время, количество циклов;

2. Пипетки;

3. Наконечники для пипеток одноразовые;

4. Эппендорфы.

Реактивы:

1. Исследуемая ДНК;

2. Taq-полимераза — термофильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках, и потому устойчивая к действию высоких температур;

3. Дезоксирибонуклеотиды: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ;

4. Два праймера к IFN-γ — олигонуклеотиды длиной 20-30п.н.;

5. Буфер, содержащий Mg²⁺.

Ход работы:

1. Приготовить ПЦР-смесь, согласно Таблице 1;

2. Добавить к ПЦР-смеси образец исследуемой ДНК в объёме 1,1 мкл (в концентрации 50-80нг/мкл);

3. Запрограммировать амплификатор, согласно схеме на Рис.6.

Таблица1. Схема приготовления ПЦР-смеси.

Реагенты	Объём на одну пробу
Прямой праймер (10мкМ)	0,36
Обратный праймер (10мкМ)	0,36
Буфер	1,2
дНТФ (2,5мМ)	0,8
MgCl2 (25мМ)	0,8
Taq-полимераза	0,1
H20	7,4

Рис.6 Схема программирования амплификатора.

Интерпретация результатов:

Контроль результатов амплифицирования проводится с помощью электрофореза в агарозном геле.

Лабораторная работа №2.

Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия (EtBr) позволяет легко, обнаружить амплифицированную ДНК и определить её размер.

Одним из примеров применения электрофореза может являться ПДРФ-анализ (рис.7). Мутации, возникающие в участках узнавания определённых рестриктаз, делают эти участки ДНК нечувствительными к действию ферментов. Это может быть легко обнаружено по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК. ПДРФ-анализ включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, её рестрикцию специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию этих фрагментов путём блот-гибридизации по Саузерну. На электрофореграммах при отсутствии рестрикции в исследуемой ДНК выявляют один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними участками рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном участке на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным участком рестрикции и одним из ближайших постоянных участков рестрикции.

Цель: освоить метод проведения электрофореза в агарозном геле.

Вопросы для самоподготовки:

1. Принцип работы гель-электрофореза.

2. Влияние компонентов электрофореза на ход реакции.

3. Области применения гель-электрофореза.

Рис.7 Применение электрофореза при ПДРФ-анализе (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) (http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lab17-Biol210.htm)

Принцип метода: разделение ДНК разной массы при помощи электрического тока. Так как молекула ДНК имеет в своём составе большое количество отрицательно заряженных фосфатных групп, то это способствует её передвижению в сторону анода. Разделение макромолекул зависит от двух переменных: заряда и массы. Линейная двухцепочечная ДНК перемещается через матрикс геля со скоростью, обратнопропорциональной десятичному логарифму (lg) числа нуклеотидных пар. Более крупные молекулы ДНК будут перемещаться медленнее, вследствие их большего сопротивления трения.

Оборудование:

1. Ванна для электрофореза;

2. Трансиллюминар;

3. Автоматические пипетки;

4. Одноразовые наконечники для пипеток.

Реактивы:

1. ТАЕ-буфер;

2. Агароза;

3. Дистиллированная вода;

4. 1% раствор EtBr (При освещении ультрафиолетовым светом, EtBr флюоресцирует оранжевым цветом, раз при связывании с ДНК интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20);

5. Библиотека ДНК.

Ход работы:

1. Сварить агарозный гель;

Для приготовления геля объёмом 100мл нам нужно смешать 2 мл 50хТАЕ-буфера и 98мл воды, добавив туда 1,5 г агарозы. Затем разогреть в микроволновке до однородного состояния и исчезновения пузырьков. Немного охладить и добавить 8мкл бромистого этидия.

2. Залить в ванночку для электрофореза, предварительно вставив туда гребёнку для формирования лунок;

3. Залить 1хТАЕ-буфером;

4. Раскапать библиотеку и образцы в лунки, предварительно окрасив образцы бромфеноловым синим;

5. Включить установку на 30 мин при U=150мВ;

1. Поместить полученный гель в трансиллюминатор для получения результатов.

Интерпретация результатов:

После визуализации результатов электрофореза с помощью трансиллюминара, мы получаем картину распределения ДНК по массе.

Рис.8 Визуализация результатов электрофореза с помощью трансиллюминара.