Вопросы для самоконтроля

1. Какие существуют основные методы выделения ДНК из живых образцов?

2. В чём состоят основные различия при выделении ДНК на колонках и с использованием органических растворителей?

3. Какая методика используется для многократного увеличения интересующей нас области ДНК?

4. Опишите принцип спектрофотометрического анализа нуклеиновых кислот.

5. Охарактеризуйте раствор ДНК, имеющий отношение 260/280 = 1,6 и 260/230 = 1,3.

Тестовые задания

Выберете один или несколько правильных ответов.

1. ПРИНЦИП МЕТОДА СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

1. Измерение вязкости раствора

2. Измерение оптической плотности

3. Измерение длины оптического пути

4. Измерение ионной силы раствора

2. К ВЕЩЕСТВАМ ИСПОЛЬЗУЮЩИМСЯ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ НУКЛЕАЗ В ПРОЦЕССЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ОТНОСЯТ

1. протеиназу К

2. колхицин

3. хаотропные соли

4. деионизованную воду

3. ЛИЗИС МЕМБРАН ПРОВОДЯТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

1. стандартного солевого раствора

2. додецилсульфата натрия

3. фенола

4. этанола

4. СВОЙСТВО МОЛЕКУЛЫ ДНК, ПОЗВОЛЯЮЩЕЕ ПРИМЕНЯТЬ ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМНЫЙ МЕТОД ДЛЯ ЕЁ ВЫДЕЛЕНИЯ НАЗЫВАЕТСЯ

1. гидрофобностью

2. гидрофильностью

3. спектральной характеристикой

4. ионной силой

5. СРЕДНИЙ КОЭФФИЦИЕНТ МОЛЯРНОЙ ЭКСТИНКЦИИ ДЛЯ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК РАВЕН

1. 0,02

2. 0,2

3. 2

4. 0,002

Занятие №3. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР И ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Полимеразная цепная реакция является универсальным методом синтеза большого количества интересующей нас последовательности ДНК.

В настоящее время существует многообразие видов и разработано множество методик проведения ПЦР, применяющихся для различных задач. Среди них выделяют ПЦР с обратной транскрипцией, ассиметричную ПЦР, ПРЦ в реальном времени, виртуальная ПЦР (ПЦР in silico). В клинической диагностике ПЦР можно применять для решения различных задач, таких как:

1. Идентификация вирусной и бактериальной ДНК в составе ДНК человека;

2. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний;

3. Выявление гетерозиготных носителей дефектных генов;

4. Идентификация дефектных генов, нарушающих регуляцию пролиферации клеток и вызывающих развитие опухолевых заболеваний;

5. Проведение анализа и идентификация дефектных генов, содержащих сильно деградированную ДНК (судебная экспертиза — идентификация личности);

6. Генетическое картирование;

7. Анализ уровня транскрипции.

Цель: Освоить метододику проведения пролимеразной цепной реакции.

Вопросы для самоподготовки:

1. Принцип метода полимеразной цепной реакции, основные этапы, условия, выбор праймеров для амплификации.

2. Модификации метода ПЦР и особенности использования ПЦР в лабораторной диагностике и медико-биологических исследованиях;

3. Правила организации и порядок проведения исследований в ПЦР лаборатории;

4. Возможные ошибки при проведении ПЦР.

Теоретическая часть

Основные этапы полимеразной цепной реакции:

1. Денатурация (94 ^oС): на этой стадии происходит разрушение водородных связей между двумя цепями молекулы ДНК. Температура денатурации подбирается исходя из двух соображений: «хорошо» денатурировать матрицу; не сильно повредить матрицу и Taq полимеразу.

2. Отжиг (57 ^oС): стадия присоединения праймеров к одноцепочечной матрице ДНК. Обычно выбирается температуру отжига на 1-5^oС меньше, чем температура плавления олигонуклеотидов.

3. Элонгация (72^oС): процесс синтеза второй цепи ДНК от 5' к 3' концу, используя праймер в качестве затравки.

Количество циклов обычно составляет 25-35.

Рис.5. Общая схема полимеразной цепоной реакции. (http://lages-lab.ru/data/image/articles/im1.gif)

Стадия пост-ПЦР: несколько дополнительных (2-5) циклов без денатурации: только отжиг и удлинение, обеспечивающих превращение некоторого остаточного количества одноцепочечных матриц в двухцепочечные.