Вопросы для самоконтроля

1. Какие типы плазмидных векторов существуют?

2. Какие ферменты используются в процессе сборки плазмидного вектора?

3. Перечислите основные способы трансформации.

4. Расскажите о строении плазмиды pUC19.

5. Расскажите о новейших методах редактирования генома.

Тестовые задания

Выберете один или несколько правильных ответов.

1. АМПИЦИЛЛИН И ТЕТРАЦИКЛИН — ЭТО

1. анальгетики

2. антибиотики

3. штаммы

4. органические красители

2. В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРОВ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ

1. вирусы

2. плазмиды

3. фаги

4. бактерии

3. КОМПЕТЕНТНОСТЬ КЛЕТОК — ЭТО

1. количество плазмидной ДНК в клетке

2. способность клеток к поглощению чужеродной ДНК из среды

3. способность клеток выживать под действием антибиотиков

4. характеристика взаимодействия генномодифицированной клетки с другими клетками

4. ИНДУКТОРОМ LAC-ОПЕРОНА ЯВЛЯЕТСЯ

1. изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид

2. 5-бром-4-хлор-3-индолин-бета-D-галактопиранозид

3. ампициллин

4. pBR322

5. ДЛЯ «РАЗРЕЗАНИЯ» ДНК С ЦЕЛЬЮ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ВСТАВКИ В ВЕКТОР ПРИМЕНЯЮТСЯ

1. лигазы

2. рестриктазы

3. хеликаза

4. апираза

Занятие №2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ

Выделение и очистка нуклеиновых кислот – это первый шаг в большинстве молекулярно-биологических исследований и во всех методиках, связанных с рекомбинантными ДНК.

Выделение ДНК является одной из основных методик, которые должен уметь выполнять студент. Необходимость этого обусловлена высокой частотой использования ДНК в лабораторной и научной практике. Для обеспечения максимальной чистоты и количества выхода и исключить содержание примесей, ингибирующих дальнейшую работу с ДНК (чаще всего ПЦР) создано множество методов выделения ДНК, которые продолжают модифицироваться и улучшаться. Создаются и совершенствуются наборы для выделения ДНК из различного типа биологического материала. Наибольшую популярность приобрели такие методы, как: На сегодняшний день, классическими методом можно считать метод выделения ДНК при помощи органических растворителей, таких как фенол-хлороформ.

Цель: освоить метод выделения плазмидной ДНК, с использованием органических растворителей.

Вопросы для самоподготовки:

1. Этапы выделения нуклеиновых кислот;

2. Основные методики очистки нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов;

3. Спектральные характеристики молекул нуклеиновых кислот.

Практическая часть

Лабораторная работа №1.

Выделение плазмидной ДНК с использованием органических растворителей.

В процессе выделения нуклеиновых кислот из биологического образца необходимо провести лизис клеток, инактивацию клеточных нуклеаз и собственно отделение нуклеиновых кислот от клеточной массы.

Принцип метода:  метод выделения геномной ДНК основан на лизисе мембран детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) с последующей экстракцией ДНК при помощи органическийх растворителей (фенола и хлороформа) (рис.4).

Рис.4 Схема выделения ДНК при помощи органических растворителей. (http://kak.znate.ru/docs/index-49305.html)

Оборудование:

1. Термостат;

2. Термокачалка;

3. Микроцентрифуга;

4. Вортекс;

5. Автоматические пипетки.

Расходные материалы:

1. Стерильные чашки Петри;

2. Стерильные стеклянные пробирки;

3. Эппендорфы;

4. Сменные носики для автоматических пипеток.

Реагенты:

1. LB на 100мл: пептон — 1г, дрожжевой экстракт — 0,5г, NaCl — 0,5г;

2. Ампициллин сток 50мг/мл (рабочая — 2 мкл/мл);

3. РНК-аза;

4. Раствор I: 8%глюкоза, 20мМ трис-HCl, pH 8,0, 100мМ ЭДТА;

5. Раствор II: 0,2М NaOH, 1% SDS;

6. Раствор III: 3М ацетат калия, pH 5,2;

7. Фенол;

8. Хлороформ;

9. 96%, 70% спирт.

Биологический материал: колонии E.Coli

Ход работы:

2. В пробирку с 3 мл среды LB, содержащей антибиотик засеять одну трансформированную колонию E.Coli с чашки и оставить на ночь при 37°С раскачиваться;

3. Осадить клетки в течении 1 мин при максимальных оборотах, супернатант удалить, осадок клеток тщательно ресуспендировать в 100 мкл раствора I;

4. Добавить 200 мкл раствора II, перемешать переворачиванием, избегая сильного встряхивания, выдержать 5 мин;

5. Добавить 200 мкл раствора III, перемешать переворачиванием и снова инкубировать 10 мин;

6. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин;

7. Супернатант аккуратно отобрать в эппендорф, добавить РНК-азу (1-100 от объёма) и прогревать 5 мин при 65°С;

8. Добавить фенол-хлороформ (400:400), центрифугировать 10 мин про 10000 об/мин;

9. Отобрать водную фазу в новую пробирку, добавить 400 мкл хлороформа, центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин;

10. Снова отобрать водную фазу, переосадить 2-2,5 объёмами спирта, инкубировать 20 мин при -20°С;

11. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промыть 70% этанолом, высушить и растворить в 20-30 мкл ТЕ буфера.

Интерпретация результатов

Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив его оптическую плотность при длине волны 260нм. Так как белки поглощают при длине волны 280нм, отношение А₂₆₀/А₂₈₀ используется для определения частоты нуклеиновых кислот. Отношение между оптическими плотностями для чистых препаратов ДНК и РНК на 260 и 280нм должно быть равно 1,8 и 2 соответственно. Поглощение на 230нм отражает загрязнение образца такими веществами, как углеводы, пептиды, фенолы или ароматические соединения. Отношение A₂₆₀/A₂₃₀ в случае чистых образцов должно быть примерно 2,2.

Концентрацию расчитывать, по закону Бугера—Ламберта—Бера, используя формулу (1), принимая средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК равным 0,020 (мкг/мл)⁻¹ см⁻¹.