Спектроскопія поверхневого плазмон-полиритонного резонансу
Для дослідження впливу прикладеного зовнішнього електричного потенціалу до чутливого елемента на відгук ПГІПР-біосенсора був використаний двоканальний оптоелектронний ГТППР-еенсор «Г1лазмон-5» (Інститут фізики напівпровідників ім. В. Є. Лашкарьова НАН України). Прилад побудований у конфігурації Кречмана із використанням ретров і до и вальної напівпентапризми повного внутрішнього відбивання з високим показником заломлення (л = 1,616) та однією дзеркальною гранню. В якості джерела світла для збудження плазмон-поляритонних коливань у приладі використовується напівпровідниковий лазер, що випромінює р-поляризоване світло з довжиною хвилі 650 нм, яке після відбивання реєструється фотодіодом. Зміна кута падіння світла у на робочу грань призми досягається шляхом її механічного обертання.
Чутливі елементи сенсора (ПППР-чіпи) приводилися у оптичний контакт із призмою за допомогою імерсійної рідини. У роботі використовувалися двоканальні відкриті комірки із об’ємом одного каналу 300 мкл та силіконовим ущільнюючим кільцем. Для проведення одночасних ПППР- та електрохімічних вимірювань у комірку були вбудовані електроди, що утворювали класичну триелектродну електрохімічну комірку, яка підключалася до потенціостату «ІРС-compact» (НТФ «Вольта», Росія) (рис. 2.13). Конфігурація електродів складалася із плівки золота у якості робочого електроду та платинового дроту товщиною 0,5 мм і квазі-Ag/AgCi електроду у якості протиелектроду та електроду порівняння, відповідно.
Для проведення ПППР'Вимірювань комірка заповнювалася розчином електроліту, буферним розчином або розчином біомолекул та проводилися вимірювання часових залежностей положення кута ГТГІПР (сенсограм) при прикладанні до межі поділу золото-електроліт зовнішнього електричного потенціалу за допомогою потенціостату. Досліджувані зразки біомолекул були виготовлені шляхом розчинення сухих порошків трипсину та соєвого інгібітору трипсину у фосфатному буферному сольовому (ФБС) розчині у концентрації 500 мкг/мл. Для зважування препаратів використовувалися аналітичні терези «Oertling ΝΑ 164» (Oertling Ltd., Великобританія) з ціною поділки 0,1 мг. Щоб зменшити похибку у концентрації отримуваних розчинів, спочатку готувався розчин концентрацією 2 мг/мл, а потім проводилося розведення до 500 мкг/мл. Отримані розчини біомолекул додавалися до другого каналу ПППР-біосенсора за допомогою мікрошприца «Gastight 1701» (Hamilton Co., США) в пропорції 100 мкл ФБС/10 мкл розчину, в результаті чого у комірці створювався розчин біомолекул концентрацією 45 мкг/мл.
Оптична спектроскопія
Методи спектроскопії розсіяння та екстинкції світла традиційно використовуються для реєстрації явища ЛППР у наноструктурах високопровідних металів [88]. Так як піки ЛППР у спектрах розсіяння га екстинкції світла двох найбільш уживаних для створення чутливих елементів ЛППР-біосенсорів високопровідних металів - срібла й золота - лежать переважно у ультрафіолетовій та видимій, рідше - у ближній інфрачервоній ділянках спектру, то для досліджень необхідно використовувати спектрофотометр УФ-видимого діапазону. Спектроскопічні методи надають можливість визначиш положення, інтенсивність та форму піків ЛППР у відповідних спектрах і відсдідкувати їх зміни (оптичний відгук ЛППР- біосенеора) при взаємодії наночастннок металу із біомолекудярними аналітами. Подальший аналіз цих мін, зокрема, із застосуванням методів математичноїх» моделювання ДППР-властивостей наноструктур, дозволяє якісно пі кількісно описати процес виявлення біомолекул ЛИПР-бюсенсором, У роботі проводилися вимірювання спектрів екстинкції світла колоїдними розчинами та масивами наноструктур золота на скляній підкладці. Для цього використовувалися спектрофотометричні установки, побудовані у геометрії «на пропускання» світла через рідинний зразок у стандартній спектрофотометричній комірці зі скла або полістиролу або через скляний чіп із розташованими на його поверхні наноструктурами. При роботі зі скляними чіпами, для забезпечення протоку рідини, що містить аналіт, над масивом наноструктур, використовувалася прозора закрита проточна комірка. Вимірювання спектрів екстинкції світла колоїдними розчинами наночастинок золота проводилися на спектрофотометрах УФ-видимого-ближнього ІЧ діапазону «UNICO SpectroQuest 4802» (United Products & Instruments, Inc., США) та «UV-ЗбОО» (Shimadzu Corp., Японія) у спектральному діапазоні 400-^800 нм із кроком 0,1+1 нм.
Крім використаного вищезгаданого устаткування, для дослідження явища ЛППР у наноструктурах благородних металів та подальшого їх використання у якості чутливих елементів біосенсора, а також з метою створення універсального портативного ЛППР-біосенсора, було спроектовано конструкцію і запатентовано [185] корисну модель ЛППР-біосенсора та виготовлено макет біосенсорного приладу «НаноПлазмон-003», який дозволяє проводити вимірювання як зразків колоїдних розчинів наночастинок, так і масивів наноструктур на скляних чіпах (рис. 2.14). Оптична система приладу містить джерело світла з неперервним спектром (галогенна лампа рожарювання потужністю 35 Вт), систему фокусування світла для створення на поверхні чіпа світлової плями діаметром від 1 мм (однолінзовий конденсор), поляризатор, оптичний хвилевід та реєстратор спектру УФ-видимого-ближнього ІЧ діапазону (компактний спектрометр на дифракційній ґратці із діапазоном вимірювань довжин хвиль 32(К900 нм). Система подачі проби до поверхні сенсорного чіпу складається із прозорої закритої проточної комірки об’ємом 200 мкл із ущільненням та перистальтичного насосу. Прилад також містить електронний блок керування оптичною системою з кроковим двигуном. З’єднання оптичної системи та системи подачі проби проводиться у напівавтоматичному режимі із використанням змінних сенсорних чіпів. Біосенсор також дозволяє працювати в режимі спектрофотометра * використанням стандартних спектрофотометричних комірок за допомогою спеціального кріплення. Портативний прилад здатний працювати як > стаціонарному, так і у мобільному варіанті під керуванням персонального комп’ютера (ноутбука). Конструкція приладу дозволяє приєднання оптичного хвилеводу до зовнішнього спектрофотометра.
2.5.5. Електрохімічні методи
Електрохімічні методи дозволяють вивчати хімічні та супутні зміни у досліджуваних системах, зокрема, і на інтерфейсі електрод-електроліт, які спричинені прикладанням електричної напруги та протіканням електричного струму. Серед різноманіття методів для вивчення електродних процесів одними з найбільш вживаних є вольтамперометричні та імпедансні методики.
Вольтамперометричні методи полягають у прикладанні до робочого електроду змінного у часі електричного потенціалу, що призводить до виникнення реакцій окислення або відновлення електроактивних компонентів
системи (фарадеївських реакцій), можливої адсорбції компонентів в залежності від значення потенціалу та заряджання подвійного електричного шару на інтерфейсі електрод-електроліт. До вольтамперометричних методів належать, зокрема, циклічна та ступінчаста вольтамперометрія. Серед застосувань методів цього класу - виявлення механізмів електрохімічних реакцій, ідентифікація компонентів розчинів та аналіз кінетики реакцій.
Методи, що базуються на вимірюваннях імпедансу, використовують прикладання до досліджуваної системи електричного потенціалу або струму, що зазвичай описується синусоїдальною залежністю від часу. Відгук системи може відрізнятися по фазі та амплітуді від прикладеного сигналу, тому вимірювання відношення амплітуд та різниці фаз між напругою та струмом (тобто модуля та аргумента комплексного імпедансу) дозволяє аналізувати електродні процеси з точки зору вкладу в них дифузії речовини, подвійного електричного шару на інтерфейсі метал-електроліт тощо. Однією із найбільш застосовуваних імпедансних методик є електрохімічна імпедансна спектроскопія, в основі якої лежить вимірювання імпедансу системи при зміні частоти джерела змінного електричного струму. Електрохімічна комірка зазвичай порівнюється із еквівалентним електричним колом (ЕЕК), що складається із резисторів, конденсаторів та інших елементів; таким чином, результати, отримані за методом електрохімічної імпедансної спектроскопії, дозволяють визначити будову та параметри складових досліджуваної системи шляхом підгонки розрахованих за моделлю ЕЕК спектрів імпедансу до експериментально виміряних.
Для проведення вольтамперометричних вимірювань використовувалася класична триелектродна електрохімічна комірка, яка описана у пункті 2.5.3, що підключалася до потенціостату «ІPC-compact» (НТФ «Вольта», Росія) (рис. 2.13). Комірка заповнювалася розчином електроліту, буферним розчином або розчином біомолекул та проводилися вимірювання циклічних або ступінчагих вольтам перо грам (із або без одночасного вимірювання ПППР-сенсограм) при прикладанні до межі поділу золото-електроліт зовнішнього електричного
потенціалу за допомогою потенціостату в циклічному або ступінчастому режимах, відповідно. Діапазони потенціалів, що прикладалися, знаходилися на проміжку -0,6+1,4 В відносно електроду порівняння. Використані швидкості розгортки потенціалу в режимі ЦВ складали від І до 50 мВ/с.
Вимірювання імпедансу за допомогою методу ЕІС проводилися у спеціально виготовленій триелектродній комірці, що відповідала гіо конфігурації електродів комірці, використаній для одночасних i ll П ІР- та електрохімічних вимірювань» на електрохімічній станції «VoItaLab-40» (Radiometer Analytical SAS, Франція). Комірка заповнювалася буферним розчином або розчином біомолекул та вимірювалися значення імпедансу системи у частотному діапазоні 0,1+50000 Гц по 5 точок на декаду при значеннях прикладеного потенціалу у діапазоні 0,2+0,6 В відносно електроду порівняння. Аналіз БЕК та визначення параметрів подвійного електричного шару шляхом підгонки проводилися за допомогою програмного забезпечення «ZView 3.3а» (Scribner Associates Inc., США).