3.5. Культивирование клеток на микроносителях

В 1967 г. VanWerel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки.

Основными преимуществами этого метода являются:

1. создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р0₂ и др.);

2. получение высокой плотности клеточной популяции до 5–6 млн. клеток в 1 мл;

3. культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток;

4. введение постоянного контроля за динамикой роста клеток;

5. снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда;

6. значительная экономии питательных сред;

7. возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах;

8. возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками;

9. возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь:

• небольшой положительный заряд в пределах 1,5–1,8 МЭКВ/г. В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН:

• плотность 1,05–1,15 г./см; указанная плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

•  диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста нескольких сотен клеток;

•  гладкую поверхность;

• прозрачность;

• отсутствие токсичности компонентов для клеток;

•  незначительное впитывание компонентов среды;

• универсальность, обеспечивающую возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и О₂, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40–60 об/мин.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток.

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ